水稻優異資源分子身份證的建立

辜大川等

摘要：研究稻種資源遺傳多樣性，發掘與利用優異種質資源是水稻品種改良及種質創新的基礎。利用中國農業部水稻品種鑒定ＤＮＡ指紋方法中推薦的２４對ＳＳＲ引物，對２７個優異水稻種質資源材料進行遺傳多樣性分析，計算遺傳相似系數并進行聚類分析，分類結果與品種親緣關系基本一致。在此基礎上，通過構建各種質資源材料的指紋圖譜，建立相應的分子身份證并探索新的建立方法，以方便區分各個種質資源。

關鍵詞：水稻；分子標記；遺傳多樣性；種質資源；分子身份證

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｑ７８９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5579-05

水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）是重要的糧食作物，不同的地理、生態、人文環境形成了豐富多樣的種質資源。優良種質資源長期保存的費用昂貴，收集新資源、鑒定和淘汰重復的資源是種質資源研究的經常性任務。隨著分子生物學的發展，分子標記技術已廣泛應用于水稻種質資源研究。研究以２７個優異水稻種質資源（包括１５個優質種質資源和１２個光溫敏核不育種質資源）為材料，進行ＳＳＲ分析、多樣性評價和聚類分析，以期為這些稻種資源的遺傳改良和雜交配組提供參考；同時制定各稻種資源的分子身份證，為品種的保護提供依據；進而探索新的分子身份證數據記錄方法的可行性，擬在不影響結果準確性的前提下，減少工作量，簡化步驟，為稻種資源鑒定提供技術支持。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

選取１５個水稻優質種質資源和１２個水稻光溫敏核不育種質資源作為供試材料（表１）。

１．２ 試驗方法

１．２．１ ＳＳＲ引物選擇 采用中華人民共和國農業行業標準《水稻品種鑒定ＤＮＡ指紋方法》（ＮＹ／Ｔ１４３３－２００７）［１］中所推薦使用的２４對核心引物。

１．２．２ 水稻基因組ＤＮＡ的提取 參照Ｍｕｒｒａｙ等［２］的ＣＴＡＢ法對水稻基因組ＤＮＡ進行提取并適當修改。

１．２．３ ＰＣＲ反應及產物分離 ＰＣＲ反應及產物分離參照中華人民共和國農業行業標準ＮＹ／Ｔ１４３３－２００７［１］。

２ 結果與分析

２．１ ＳＳＲ標記的多態性

２４對ＳＳＲ引物在２７個資源中共擴增出了１０４個等位變異片段，平均每對引物擴增的條帶數為４．３條，圖１是引物RM274擴增的結果，24對引物擴增的遺傳多樣性信息如表２所示。由表2可知，引物擴增的條帶數從２條至７條不等，其中ＳＳＲ引物ＲＭ２１９與ＲＭ２５８擴增的條帶數均為７，為所有引物中最多。從各引物擴增的條帶數量分布上來看，擴增條帶數為２條和７條的引物數量均為２對，各占８．３％，擴增條帶數為６條的引物數量為３對，占１２．５％，此外，分別有４對引物擴增的條帶數為３和５條，各占１６．７％，而擴增條帶數量為４條的引物有９對，數量最多，占３７．５％，即等位基因位點為３～５個的引物占全部引物的７０．８％。２４對ＳＳＲ引物在２７個資源中的平均Ｎｅｉ基因多樣性指數為０．５３３，不同引物的Ｎｅｉ基因多樣性指數變化范圍為０．０７１～０．８２０。由于Ｎｅｉ基因多樣性指數是等位基因數和頻率的函數［４］，因此具有較高基因多樣性指數的ＳＳＲ標記（如ＲＭ２５８）具有較高的檢測效率。

２４對ＳＳＲ引物在１５個優質水稻資源中共擴增出８５條條帶，引物擴增的條帶數從２條至６條不等，平均每對ＳＳＲ引物擴增的條帶數為３．５條；不同引物的Ｎｅｉ基因多樣性指數變化范圍為０．１２４～０．７３８，平均Ｎｅｉ基因多樣性指數為０．４８２。而在光溫敏核不育資源中共擴增出７６條條帶，每對引物的擴增條帶數同樣從２條至６條不等，平均每對ＳＳＲ引物擴增條帶數為３．２條；不同引物的Ｎｅｉ基因多樣性指數變化范圍為０～０．７７８，平均Ｎｅｉ基因多樣性指數為０．４９７，略高于優質資源。

２．２ 水稻資源間的遺傳相似性分析

根據ＳＳＲ分子標記數據得到的在優質資源和光溫敏核不育資源總共２７個資源中的遺傳相似系數變化范圍為０．５４８１～０．９３２７，平均遺傳相似系數為０．７５３６，其中資源１８９２Ｓ和Ｃ８１５Ｓ的遺傳相似系數最大，為０．９３２７，表明兩者的親緣關系在所用試驗種質資源中較近；資源０４－６５７與０４－６５８的遺傳相似系數最小，為０．５４８１，表明兩者的親緣關系在所用試驗種質資源中較遠。忽略優質資源和光溫敏核不育資源各自自身的聚類，兩個資源群體間的遺傳相似系數為０．５８６５～０．８８４６，其中遺傳相似系數為０．８８４６的兩個資源分別是Ｂａｓｍａｔｉｓｕｐｅｒｆｉｎｅ與２３０１Ｓ，而遺傳相似系數為０．５８６５的兩個資源分別是０４－６５８和１１０３Ｓ。

將優質資源的ＳＳＲ分子標記數據單獨統計，進行遺傳相似系數的計算，其變化范圍為０．４４７１～０．８７０６，平均遺傳相似系數為０．７０４３。優質資源霸王占與９５９８的遺傳相似系數最大（０．８７０６），而優質資源０４－６５７與０４－６５８的遺傳相似系數最小（０．４４７１），該結果與２７個資源總體聚類結果吻合。

將光溫敏核不育資源的ＳＳＲ分子標記數據單獨統計，進行遺傳相似系數的計算，其變化范圍為０．４４７４～０．９０７９，平均遺傳相似系數為０．６５７３。不育資源１８９２Ｓ和Ｃ８１５Ｓ的遺傳相似系數最大（０．９０７９），該結果符合２７個資源總體聚類結果，而不育資源１１０３Ｓ與ＨＮ５Ｓ－１２的遺傳相似系數最小（０．４４７４）。

２．３ 水稻資源間的聚類分析

圖２、圖3、圖4分別為優質資源、光溫敏核不育資源以及優質和光溫敏核不育資源總體的ＵＰＧＭＡ聚類分析結果。從圖２可以看出，在遺傳相似系數０．５８處，可以將優質資源分為兩類，Ⅱ類只包含一個泰國資源０４－６５８，剩下的其他１４個資源為Ⅰ類，表明泰國資源０４－６５８與其他優質資源的親緣關系較遠。在Ⅰ類中，在遺傳相似系數接近０．７２處，又可分為５類，鑒真２號、Ｂａｓｍａｔｉ、晚秈９８分別單獨為一類，泰國資源０４－６５７與Ｂａｓｍａｔｉｓｕｐｅｒｆｉｎｅ聚為一類，以鄂中５號、銀占等為代表的湖北資源聚為一類，以西山占、霸王占等為代表的廣西資源聚為一類，分類大致接近于同一地理資源來源聚為一類。分析不育資源聚類分析圖（圖３），在遺傳相似系數０．６１處，可將這些不育資源分為三類，Ⅰ類中的資源有１８９２Ｓ、Ｃ８１５Ｓ、Ｙ５８Ｓ、15S、培矮６４Ｓ、ＨＮ５Ｓ－１２和ＨＮ５Ｓ－１１，這7個資源中的前3個均與培矮６４Ｓ有親緣關系；Ⅱ類資源有２３０１Ｓ、廣占６３Ｓ、Ｍ６３０３Ｓ和ＨＤ９８０２Ｓ，其中的Ｍ６３０３Ｓ與廣占６３Ｓ存在系譜上的親緣關系；Ⅲ類材料僅有１１０３Ｓ。分析優質資源和不育資源的聚類分析圖（圖４），在遺傳相似系數０．７０處可將２７個資源分為四類，Ⅱ類包含珠海占與１１０３Ｓ，Ⅲ類為晚秈９８，Ⅳ類包含０４－６５８與ＨＤ９８０２Ｓ，其他２２個資源組成Ⅰ類。