轉基因家畜安全性的解決方案

魏慶信　鄭新民

摘要：建立安全的轉基因家畜生產(chǎn)技術體系是保障人體健康和動物安全、保護生態(tài)環(huán)境、促進農業(yè)轉基因生物研究和產(chǎn)業(yè)化的需要。從食品安全、環(huán)境安全以及家畜自身安全等３個方面分析了轉基因家畜各生產(chǎn)環(huán)節(jié)可能影響安全性的諸因素，并從技術和管理的角度提出了解決方案。

關鍵詞：家畜；轉基因；安全性；解決方案

中圖分類號：Ｓ８１４．８；ＴＳ２０１．６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5562-05

應用轉基因技術對家畜進行遺傳改良，必將給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來革命性的變化。與此同時，同其他轉基因生物一樣，其安全性也引起了廣泛關注。世界各國紛紛加強對轉基因生物安全性的研究，力圖通過各種技術措施消除轉基因生物的安全隱患，并制定相應法律、法規(guī)和制度對轉基因生物的安全性進行管理。《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》（國務院，２００１）總則第一條指出：“為了加強農業(yè)轉基因生物安全管理，保障人體健康和動植物、微生物安全，保護生態(tài)環(huán)境，促進農業(yè)轉基因生物技術研究，制定本條例”［１］。根據(jù)對上述文字的理解，轉基因家畜的安全性應包括３個方面：一是食品安全性，轉基因家畜的主要產(chǎn)品是人類的食品；二是環(huán)境安全性，轉基因家畜的環(huán)境釋放會影響環(huán)境安全，也即生態(tài)安全的隱患；三是轉基因家畜自身的安全性，家畜轉基因之后，有可能會出現(xiàn)生存能力和適應性的變化。轉基因家畜與轉基因農作物相比發(fā)展滯后，到目前為止還沒有大批量的商業(yè)化產(chǎn)品上市。然而轉基因家畜的產(chǎn)生卻已有２０多年的歷史，有些已進入中間試驗、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗階段。隨著中國“轉基因生物新品種培育”重大專項的強力推進，其商業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)為期不遠。為促進轉基因家畜試驗研究和產(chǎn)業(yè)化的健康發(fā)展，本文根據(jù)中國《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》所涉及到的以及目前所能認識到的一些主要問題，提出轉基因家畜安全性的解決方案，僅供參考。

１ 轉基因家畜食品安全性的解決方案

可能影響轉基因家畜食品安全性的因素主要有如下幾方面：①轉入基因的構件（包括目的基因、載體、標記基因等）及其表達產(chǎn)物；②非預期效應；③受體家畜的安全性。

１．１ 轉入基因的構件及其表達產(chǎn)物

１．１．１ 目的基因及其表達產(chǎn)物 目的基因表達的蛋白是轉基因家畜的目標產(chǎn)物，是可能影響食品安全性的直接因素。以高效、優(yōu)質生產(chǎn)食品為目標的家畜轉基因遺傳改良，大體可分為如下幾類：①提高畜產(chǎn)品的產(chǎn)量；②改善畜產(chǎn)品的品質；③提高家畜的抗病力；④加強環(huán)境保護，如降低磷的排放量等。

１９９３年，國際經(jīng)濟發(fā)展合作組織（ＯＥＣＤ）提出了食品安全性分析的原則——實質等同性（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）原則［２，３］，目前各國都以這一原則為基礎，對食品包括轉基因食品的安全性進行管理和評價。實質等同性的概念為：如果某種新食品或食品成分與現(xiàn)有的某一食品或成分大體相同，那么在安全性方面，兩者可等同處理，即新食品與傳統(tǒng)食品同樣安全。按照實質等同性原則，轉基因家畜中轉基因編碼的蛋白可分為兩類：

一類是已經(jīng)存在的某一食品成分，與現(xiàn)有的食品成分具有完全的等同性。例如：轉基因豬高表達的ω－３不飽和脂肪酸酶，轉基因奶牛表達的人乳清白蛋白、人乳鐵蛋白等，這些都是已經(jīng)存在于人類食品中的營養(yǎng)成分，具有安全性。

另一類是已經(jīng)存在的食品中尚沒有的成分，即所謂“新蛋白”。對人類健康有危害的蛋白有兩類：一是毒素，即對人體有毒性的蛋白；二是可成為過敏原的蛋白。通過使用歐洲分子生物信息學網(wǎng)基因序列庫ＥＭＢＬ、蛋白序列庫ＳＷＩＳＳＰＯＲＴ，根據(jù)對毒素蛋白質和ＤＮＡ序列的查詢，共發(fā)現(xiàn)各種毒蛋白１４５８種［４］。這為我們在選擇目的基因時，排除毒蛋白的表達提供了依據(jù)。對于可能形成過敏原的蛋白，１９９６年國際食品生物技術委員會和國際生命科學研究所發(fā)展了一種稱為“樹型判定法”的程序來進行過敏原性分析［５］，２００１年再次對其作了修訂。依照“樹型判定法”，在設計轉基因家畜目的基因時，應進行如下分析：①轉基因的來源，如來自已知過敏原的材料，就避免用于轉基因；②序列同源性，將轉基因編碼的蛋白與已知過敏原的氨基酸序列進行比較；③編碼新蛋白的免疫化學分析，與有關過敏患者血清ＩｇＥ是否存在交叉反應；④耐酸性或耐消化性，多數(shù)過敏原能耐受胃酸和消化道蛋白酶的水解；⑤熱穩(wěn)定性或耐受加工處理，熱不穩(wěn)定的過敏原若在需經(jīng)熟食處理、或經(jīng)加工處理的食物中，則無需擔心過敏性［６］。選擇目的基因之后，還應對其表達產(chǎn)物進行毒理學評價。通過上述分析篩查和評價過程，可確保目的基因及其表達產(chǎn)物的安全性。

１．１．２ 載體 動物基因工程常用的載體有質粒載體和病毒載體，其中病毒載體的安全性受到廣泛關注。構建轉基因動物常用的是逆轉錄病毒載體，其中的慢病毒載體由于整合效率較高近年來得到快速發(fā)展。一般情況下通過包裝細胞分泌的病毒已經(jīng)喪失了自我復制的能力，但當病毒轉染目的細胞后經(jīng)過基因組整合，在一定條件下病毒轉錄表達的同時可以促使其相鄰的目的細胞的某些基因也表達，若這些基因與輔助病毒的基因具有高度同源性的時候，將大大提高產(chǎn)生具有自我復制能力的逆轉錄病毒（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＲ）的可能性［７］。用逆轉錄病毒為載體有可能在轉基因動物體內合成新的感染性病毒［８］。逆轉錄病毒載體的插入還可能會激活附近的內源性基因表達，從而觸發(fā)被轉染細胞的表型轉變［９］，這稱之為“插入誘變”。插入誘變可能發(fā)生最嚴重的副作用是誘導癌基因的表達。盡管有些逆轉錄病毒載體（例如第二、第三代慢病毒載體）已經(jīng)進行了改造，其安全性大大提高，但對病毒載體的使用仍需持謹慎態(tài)度。

１．１．３ 標記基因 標記基因（Ｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ）是選擇標記基因（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ）的簡稱，可分為兩類：一類是指其編碼產(chǎn)物能夠使轉化的細胞具有對抗生素的抗性，在培養(yǎng)基中加入抗生素等選擇試劑，非轉化的細胞死亡或生長受到抑制，而轉化的細胞能夠繼續(xù)存活，從而將轉化的細胞從大量的細胞中篩選出來的一類基因。構建轉基因動物常用的這類標記基因有ｋａｎ（卡那霉素）、ａｍｐ（氨芐青霉素）、ｎｅｏ（氨基糖苷磷酸轉移酶基因）、ｔｋ（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一類也稱報告基因（Ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ），是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導人受體細胞、組織或器官，并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。目前轉基因動物常用的報告基因是ＧＦＰ（綠色熒光蛋白基因），由ＧＦＰ衍生出來的還有ＢＦＰ（藍色熒光蛋白基因）、ＹＦＰ（黃色熒光蛋白基因）等各種可視光的熒光蛋白基因。

轉基因成功之后，這些標記基因留在轉基因個體中，并隨著轉基因個體的擴群繁殖傳遞給后代。這些帶有標記基因的動物及其產(chǎn)品是否具有不安全的因素，還需要大量的試驗和時間來證明。但可能的食品安全隱患有如下幾方面：①當人們食用了轉基因動物的產(chǎn)品，標記基因編碼蛋白有可能被轉移到人體的細胞或腸道微生物中，從而可能會降低抗生素在臨床治療中的有效性；②標記基因編碼蛋白是否會成為新的致敏原，尚不得而知；③報告基因的存在會讓消費者產(chǎn)生一種心理排斥反應。

標記基因的功能是把轉化的和未轉化的細胞、組織區(qū)分開。但是，一旦完成篩選得到所需要的轉化細胞、或完成轉基因動物的構建之后，標記基因就變成不需要的和多余的。為了消除標記基因的安全隱患，目前我們能夠采取的解決方案：一是在篩選轉化細胞或構建成功目的基因表達的動物之后，剔除標記基因；二是使用無標記基因的轉基因技術。

位點專一性重組系統(tǒng)能有效地對目標基因進行剔除，目前可用于動物基因剔除的有Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ和ＦＬＰ／ｆｒｔ系統(tǒng)，其中以Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ應用較多。Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ系統(tǒng)是利用Ｃｒｅ重組酶的重組特性，將選擇標記基因置于兩個Ｌｏｘｐ位點之間，目的基因置于Ｌｏｘｐ位點之外，通過Ｃｒｅ蛋白的識別重組，使兩個Ｌｏｘｐ位點之間的ＤＮＡ區(qū)段與動物基因組之間發(fā)生置換，從而剔除選擇標記基因，獲得只含有目的基因的轉基因動物［１０］。ＦＬＰ／ｆｒｔ與Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ重組原理基本相似，也是利用ＦＬＰ基因編碼的重組酶，可以識別ｆｒｔ位點并進行重組［１１］。

無標記基因的家畜轉基因技術其實早已有之，先期建立的顯微注射、精子介導等方法，都可以不使用標記基因，而是依靠分子生物學技術在個體水平或胚胎水平上進行篩選。其中又以原核的顯微注射法重復率高，效果可靠。只是這些方法導入的外源基因一般是隨機整合的，后期篩選的工作量大。

１．２ 非預期效應

非預期效應指的是在考慮了目的基因插入產(chǎn)生的預期效應的情況下，轉基因與非轉基因親本（在相同環(huán)境和條件下）在表型、反應和組成上所顯示出的統(tǒng)計學顯著的差異［１２］。轉基因植物的非預期效應一般認為是由于外源基因的隨機整合所導致。根據(jù)已有轉基因家畜研究的情況分析，可能引發(fā)轉基因家畜非預期效應的因素主要來自于兩方面：①外源基因的隨機整合；②某些種類目的基因的非可控表達。

１．２．１ 隨機整合引發(fā)的非預期效應 隨機整合是指外源基因不受人為控制，隨機地插入任意染色體的任意位置。研究表明，轉基因生物由于外源基因的隨機插入，可能通過以下幾種機制改變內源基因的表達進而導致非預期效應的產(chǎn)生：①外源基因插入內源基因的“閱讀框”，破壞基因的核酸序列使其不能有效表達；②外源基因插入內源基因調控元件的“功能區(qū)”，使調控基因失去功能，導致受其調控的內源基因不能有效表達；③外源基因插入基因組的某個“敏感域內”，使原本“沉默”的內源基因被“激活”而高效表達；④外源基因的轉錄或表達產(chǎn)物成為誘導或抑制內源基因表達的活性因子，直接或間接地使這些內源基因的表達發(fā)生質或量的改變［１３］。無論哪一種原因引起轉基因生物細胞成分的改變，都將導致食品成分的改變，而食品成分的任何一種改變都會與人類健康密切相關。因此隨機整合引發(fā)的非預期效應是引起食品安全性問題的重要原因之一。

解決轉基因家畜隨機整合的方案，就是采用基因打靶技術，將事先設計好的ＤＮＡ序列插入選定的目標基因座，或者用事先設計好的ＤＮＡ序列去取代基因座中相應的ＤＮＡ序列，即實現(xiàn)定位整合（或靶向修飾）。目前，已建立的家畜基因組靶向修飾技術有：體細胞核移植途徑的靶向修飾技術、鋅指核酸酶（ＺＦＮｓ）介導的靶向修飾技術和ＰｈｉＣ３１整合酶介導的靶向修飾技術。相對于體細胞介導的基因組靶向修飾，ＺＦＮｓ技術和ＰｈｉＣ３１整合酶技術具有如下優(yōu)勢：①效率高，相比傳統(tǒng)的同源重組方法提高了３～４個數(shù)量級；②不需要藥物篩選，不引入標記基因，省卻了刪除標記基因的繁瑣程序；③可以在胚胎水平上進行基因導入，通過簡單的顯微注射技術即可獲得靶向修飾的轉基因動物。除此之外，ＺＦＮｓ技術還有可能實現(xiàn)雙等位基因的靶向修飾，能夠一次性得到純合子個體，這對于轉基因家畜育種尤其有利。

１．２．２ 目的基因非可控表達引發(fā)的非預期效應 目的基因的非可控表達，包括過量表達、非特定發(fā)育階段的表達以及非組織特異性的表達。某些種類目的基因（如生長激素類基因）的過量表達有可能影響轉基因家畜的健康和食品的安全性。如：２０世紀８０年代，將生長激素類基因導入家畜，有少數(shù)轉基因家畜由于激素表達量過高而導致生長發(fā)育不正常［１４］，過量激素的蓄積還可能影響食品的安全。有些基因在胚胎階段或幼畜階段表達，有可能導致胚胎或幼畜發(fā)育的不正常。轉基因隨著胚胎的發(fā)育進入到各種組織細胞并在各種組織中表達，有些基因的表達產(chǎn)物會對其他組織基因的表達產(chǎn)生干擾，從而影響轉基因家畜的健康和食品的安全性。因此，調控某些基因的表達量、調控其在發(fā)育的特定階段和特定組織中進行表達就很有必要。轉基因可誘導表達系統(tǒng)和組織特異表達系統(tǒng)為上述問題提供了解決途徑。

目前用于家畜可誘導表達比較成熟的是四環(huán)素（Ｔｅｔ）誘導表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)相當于轉基因表達的開關，在需要的時段在家畜的飼料中添加誘導劑使基因開啟，不需要的時候去掉誘導劑、沉默子抑制目的基因的表達使基因關閉。轉基因動物中外源基因的組織特異性表達依賴于組織特異性表達基因的啟動子和上游調控區(qū)，可以通過不同啟動子的選擇，使目的基因實現(xiàn)特定時間和特定器官組織的表達。例如乳腺特異性表達載體需要三部分有效的構件：乳蛋白基因啟動子及５′上游調控區(qū)、目的基因和包含ｐｏｌｙ（Ａ）信號的基因３′端及下游區(qū)。乳蛋白基因的５′上游調控區(qū)包含有激素應答元件等時空特異表達調控位點，能準確地控制目的基因表達的特異組織（乳腺）和時間階段。

１．３ 受體家畜的安全性

受體家畜的安全性無疑對轉基因家畜的安全性產(chǎn)生最直接的影響。考古研究表明，早在新石器時代，人類就開始飼養(yǎng)家畜，家畜作為人類的食品至少已有６０００～７０００年的歷史，其自身并無安全性的問題。但有些攜帶人畜共患傳染病原的家畜，會將病原傳染給人類，可對人類健康產(chǎn)生不利的影響；攜帶其他傳染病原的家畜會危害轉基因家畜的健康。因此，用于轉基因受體的家畜必須進行嚴格的檢疫，攜帶人畜共患傳染病原或其他傳染病原的家畜不能用作受體。為了防止病原的感染，作為轉基因受體的家畜應在相對凈化和隔離的環(huán)境下飼養(yǎng)，同時應做好嚴格的免疫接種、消毒、衛(wèi)生等防疫工作。

２ 轉基因家畜環(huán)境安全性的解決方案

轉基因生物的環(huán)境或生態(tài)安全風險，是通過基因漂移實現(xiàn)的。基因漂移有２種方式，即基因的垂直漂移（Ｖｅｒｔｉｃａｌｇｅｎｅｆｌｏｗ）和水平轉移（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ）［１５，１６］。

基因水平轉移通常指基因在親緣關系很遠的物種之間進行交換和移動，多發(fā)生于微生物的物種之間。可能引起轉基因家畜基因水平轉移的途徑有以下幾種：①腸道微生物。轉基因家畜的外源ＤＮＡ與腸道微生物進行基因交換重組，從而發(fā)生轉移并形成新的致病微生物；②畜舍內的其他動物，如蚊、蠅、老鼠等。當蚊吸食轉基因動物的血液之后，再吸食其他動物的血液；蠅、老鼠食用了轉基因動物的排泄物之后，再四處飛行或流竄，從而發(fā)生轉移；③排泄物。轉基因家畜的糞便施放到田地作為肥料，其中可能含有未降解的細胞或細胞碎片。分析上述①的途徑，整合在動物基因組的外源ＤＮＡ，如果能發(fā)生與腸道微生物進行基因交換重組，其實與內源基因是等同的。但腸道微生物是伴隨著動物的出現(xiàn)就一直存在的，并未見動物的ＤＮＡ與腸道微生物ＤＮＡ發(fā)生交換重組的現(xiàn)象，也不具備這種機制。已知微生物之間可通過轉導、轉化或接合進行基因轉移，但尚無裸露ＤＮＡ在腸胃系統(tǒng)中轉入微生物的報告［１７］。至于上述②、③的途徑，顯而易見，圈養(yǎng)的動物與在大田里生長的植物相比，上述可能引起基因水平轉移事件發(fā)生的概率要低得多。就轉基因生物安全的風險評價而言，風險是危害性及其發(fā)生概率的函數(shù)，即：風險＝危害性×發(fā)生概率。即使對于植物，目前也還沒有充足的證據(jù)表明，基因的水平轉移會導致轉基因逃逸和帶來明顯的環(huán)境安全問題［１５］。

基因的垂直漂移是指通過有性雜交的方式發(fā)生于親緣關系很近或同一物種不同群體之間的基因交換。轉基因植物的基因垂直漂移，通常可以通過３種不同的媒介來實現(xiàn)，即花粉介導、種子傳播介導和無性繁殖器官介導的基因漂移［１５］。家畜（哺乳動物）與植物不同的是，其受精過程是在體內完成的，不存在如轉基因植物由于花粉或種子介導的“基因漂移”問題；同時家畜在自然狀態(tài)下不能進行無性繁殖，也不存在無性繁殖器官介導的基因漂移。惟一可能造成基因垂直漂移的途徑，就是轉基因家畜的逃逸。轉基因家畜從圈舍內逃出，與非轉基因家畜交配，從而造成轉基因的逃逸。而防范轉基因家畜的逃逸，可以通過如下措施加以控制：①轉基因家畜的研發(fā)或生產(chǎn)必須在專用的圈舍內進行；②轉基因家畜的畜舍與非轉基因家畜的畜舍之間要有嚴格的隔離設施和隔離帶；③按照中國“農業(yè)轉基因生物及其產(chǎn)品安全控制措施”的規(guī)定，制定嚴格的防止轉基因家畜逃逸的管理制度和應急措施。

３ 轉基因家畜自身安全性的解決方案

轉基因家畜自身的安全性，根據(jù)《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》附錄ＩＩ“轉基因動物安全評價”［１８］，可理解為相對于受體家畜，其存活能力、繁殖、遺傳及其他生物學特性的改變。從轉基因動物生產(chǎn)過程到外源基因的表達，都有一些影響轉基因動物自身安全性的因素。本文的第一部分可能影響轉基因家畜食品安全性的因素中，已經(jīng)涉及到一些影響轉基因家畜自身安全性的因素，其中比較重要的是載體和非預期效應。除此之外，轉基因方法也對轉基因家畜自身的安全性產(chǎn)生一定的影響。現(xiàn)有的每一種轉基因家畜制作方法都存在自身的一些缺陷。顯微注射法、精子介導法、病毒感染法以及其他非同源重組的方法，外源基因一般是隨機整合，整合位點的不確定性可能帶來非預期效應，不僅影響食品安全性，也影響轉基因家畜自身的安全性，而且首先表現(xiàn)的是對轉基因家畜自身安全性的影響。病毒感染法還存在病毒載體帶來的安全性隱患。體細胞核移植介導的轉基因方法，與基因打靶技術相結合，雖然能實現(xiàn)定位整合（靶向修飾），但其產(chǎn)生的部分克隆動物確實存在健康問題。體細胞核在卵胞質中重編程的不完整性（或其他原因），有可能會導致部分轉基因動物其解剖結構、生理功能和行為方式上的些許改變，這些變化可能會對動物自身的健康造成影響和存活能力的下降，如死胎、胎兒肥大、早期流產(chǎn)、成年后表型和解剖學異常等現(xiàn)象［１９］。

上述問題的解決方案可以從兩方面考慮：其一是對不管是用哪一種方法獲得的轉基因家畜，都應加強生長發(fā)育、繁殖、遺傳及各種生物學性狀的監(jiān)測和評估。對于用作生物制藥的轉基因家畜，在動物血液中是否有藥物的殘留、藥物的實際含量，對動物消化系統(tǒng)中的微生物菌區(qū)的微生物是否有一定影響，是否對該種藥物產(chǎn)生特定的抗藥性都應仔細監(jiān)測。通過監(jiān)測和評估，淘汰有異常表現(xiàn)的個體，保留具有正常生長發(fā)育態(tài)勢、繁殖和遺傳穩(wěn)定的個體。已有的轉基因動物的試驗表明，出現(xiàn)上述存活能力下降的只是少數(shù)。其二是改進現(xiàn)有的轉基因技術，使其更具安全性。例如：通過顯微注射途徑的ＺＦＮｓ技術和ＰｈｉＣ３１整合酶技術，既可以實現(xiàn)靶向修飾，又可以規(guī)避目前克隆技術的一些弊端。從能在細胞水平上對轉基因的整合和表達進行篩選而言，體細胞介導的轉基因方法仍有不可替代的優(yōu)勢，目前應著力研究體細胞重編程的機理，提高完整重編程的效率，從而提高克隆效率、減少轉基因克隆家畜的異常。

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