飼糧添加葉酸可緩解斷奶仔豬的免疫應激

高 慶張克英陳代文

(1.四川農業大學動物營養研究所，教育部動物抗病營養重點實驗室，四川雅安 625014；2.四川鐵騎力士實業有限公司，馮光德試驗室，四川綿陽 621006)

生產實踐和試驗研究都證實仔豬斷奶階段的生產性能在很大程度上會影響生豬的上市時間和生產效益。減少斷奶仔豬腹瀉，保障仔豬在斷奶后健康正常的生長仍然是當前養豬生產的技術難題，其主要原因在于斷奶仔豬的抗病力滯后于生產的需求。而養豬業中禁用抗生素在世界范圍內正逐漸成為共識，為保障豬的健康生長需要以營養調控手段來提高豬體自身的免疫力。研究仔豬的抗病營養，無疑既具有理論意義，也具有實踐價值。而已有研究表明，在飼糧中補充適宜劑量的一些功能性養分可以調節或增進斷奶仔豬的免疫功能，提高仔豬抗病力，減少仔豬斷奶期疾病感染或免疫應激的危害。

1 仔豬斷奶期的免疫應激

仔豬出生后免疫系統尚未發育完全，初生仔豬的免疫保護主要靠初乳傳遞母源抗體的被動免疫方式獲得，而不是自身機體細胞介導的免疫。3～4周齡是仔豬免疫系統發育特別是免疫細胞發育成熟的關鍵時期。仔豬的非特異免疫系統的發育成熟和建立，至少在7～14日齡后才能完成，而B、T細胞發育成熟的時間比嗜中性白細胞和巨噬細胞的分化成熟更晚，一般要遲1～2 w時間。此時，仔豬自身的主動免疫尤其是特異性免疫功能也還未成熟和完善。仔豬大約在3周齡開始產生主動免疫抗體，但直到4～5周齡時所產生的抗體仍然較少。因此，3～5周齡（斷奶期）是仔豬最關鍵的免疫功能調節時期，而此時的仔豬往往還要面對斷奶應激。

斷奶帶來的巨大變化需要仔豬適應。首先，仔豬不得不攝食形態和組成發生變化了的飼糧。斷奶期飼糧含有大量仔豬從未接觸過的飼料原料，干物質含量急速地提高到88%左右，而飼糧消化率較母乳低。與豬乳的干物質組成不同，飼糧干物質中含有動植物源蛋白質、大量的淀粉和較少的脂肪。仔豬消化道需要從以消化脂肪為主轉變為消化復雜的碳水化合物為主。斷奶后幾小時內，消化道結構和功能開始改變，腸絨毛高度降低，隱窩深度增加，消化酶出現變化。

現實生產中，斷奶后1～3 w內，仔豬往往攝食不足。特別是斷奶后的24～48 h，因為尚未適應食物的變化等因素，仔豬甚至可能出現絕食現象。由于攝食不足，以及飼料組成上抗原增加等原因，斷奶仔豬易發生腸道黏膜炎性損傷；而與飼料養分消化率較低相聯系，小腸內腸毒性細菌可能開始繁殖，大腸內或將發酵難以消化的養分，這會導致腸道微生態惡化甚至腹瀉。此外，斷奶仔豬還被迫面臨拆窩、分群以及生活環境的改變等，這些因素可在其生理和心理上造成應激。以上應激和挑戰可能會造成仔豬在斷奶后1 w或更長時期內生長減慢，甚至出現減重（負增重）現象，這就是斷奶期的生長抑制。而仔豬生長受抑制的程度則取決于仔豬如何適應新環境并在身心上到達新的穩態。

與斷奶期的生長抑制密切聯系的是仔豬很容易出現免疫應激。免疫應激一般指動物機體應對襲入的抗原、毒素或病原體而出現免疫系統過度活化或者抑制，免疫反應、神經內分泌及相關物質代謝偏移正常狀態，而機體處于亞臨床癥狀的過程。已經斷絕了從母乳獲得被動免疫保護，斷奶仔豬本身的免疫系統還未發育成熟，而斷奶迫使仔豬接觸大量的來源于飼糧及環境中的抗原、病原體及毒素，仔豬機體的免疫反應容易被過度激活，導致免疫系統更加脆弱，在面臨進一步的病原體攻擊下機體又很容易出現免疫抑制。前人研究發現，與自然吮乳仔豬相比，2～3周齡斷奶仔豬循環抗體滴度下降，細胞免疫受到抑制，表現出明顯的免疫抑制，因而仔豬抗病力差，容易患病。

2 仔豬免疫應激模型

由于免疫應激在動物生產中比較普遍，如用免疫應激模型來評價功能性養分對于動物機體免疫功能的影響則具備實用價值。豬的免疫應激源很多，包括豬場病原性或非病原性微生物、疫苗和異源蛋白等能刺激豬免疫系統的物質。可利用這些免疫應激源建立免疫應激模型。前人研究報道中，對照組可采用對豬舍進行消毒或實施“隔離早期斷奶”和“全進全出”等措施來減少豬群與病原體接觸，而免疫應激組豬群則與豬場病原體密切接觸，從而建立比較接近生產實際的模型。但這類模型存在穩定性差而風險高、不易控制應激程度、缺乏特異性敏感指標來衡量等缺點。另可采用毒素如脂多糖（LPS）或病原體(如大腸桿菌、輪狀病毒)攻擊感染健康豬來建立模型，這是目前建立免疫應激模型的趨勢。免疫應激源效應不一，而建立這類模型時可選用特定已知功效的抗原、毒素或病原體攻擊健康動物機體，能有目的地使機體處于特定的免疫應激狀態。依據受到攻擊后機體所處免疫應激狀態的不同，可將免疫應激模型分為免疫抑制模型和免疫活化模型。

從豬腹膜、肌肉或靜脈注射一定劑量的LPS，激活豬的免疫系統，這是目前常用的免疫活化模型。LPS是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、奈瑟氏球菌屬等）細胞壁結構物質，能誘導豬產生細菌感染后的癥狀，如厭食、嗜睡和發熱等。LPS與巨噬細胞表面受體CD14結合，可刺激巨噬細胞合成和分泌IL-1、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子，急速地激活豬的免疫抵抗機制，導致豬免疫系統活化。一般情況下，LPS誘導急性的免疫激活，應激反應持續的時間較短，而次數過多的LPS刺激又可能使豬產生耐受性。而較長的應激持續時間才有利于進行動物營養方面的研究。本課題組在前人研究基礎上，經過預試驗確定了LPS注射劑量和注射頻次，建立了應激持續時間為7 d的LPS免疫激活模型。盡管LPS刺激與豬場中活細菌誘導的免疫反應并不一樣，LPS模型也不能完全模擬在實際豬場條件下常見的慢性免疫應激，但LPS攻毒建模還是因為其效應比較確定，以及應激程度相對可控制，而應用較普遍。本課題組已多次成功地將LPS攻毒模型應用于動物營養與免疫的研究。

斷奶仔豬容易感染豬圓環病毒-2（porcine circovirus-2，PCV-2），其免疫系統的正常發育受到影響，出現嚴重的免疫抑制。而在其他一些誘因或病原體共同作用下，PCV-2感染成為導致仔豬斷奶期多系統衰弱綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy sydrome,PDNS）等疾病的主要病因，使仔豬生產性能下降。生產上PCV-2感染仔豬危害巨大，利用PCV-2攻毒所建立免疫抑制模型可以更接近生產。PCV-2是一種嗜單核-巨噬細胞性的病毒，感染單核-巨噬細胞和樹突狀細胞卻不在其內復制，也不引起巨噬細胞凋亡，而B細胞可能是其復制的重要靶細胞，PCV-2感染將引起B細胞凋亡，感染初期的PMWS豬淋巴組織和骨髓樣組織的凋亡指數卻比對照組低；感染PCV-2引起豬組織IL-4、IL-10、IFN-α、MCP-1等細胞因子的水平發生變化，淋巴細胞不能有效地激活和增殖，巨噬細胞表面抗原MHC-I類分子和MHC-II類分子表達下降，而增殖不足的影響大于細胞凋亡，使外周血液中B細胞和T細胞減少等對免疫系統的損傷和抑制。試驗研究和生產上都發現斷奶仔豬的營養狀況可影響豬體對PCV-2的感染或繼發感染的耐受能力。本試驗室已經成功利用PCV-2攻毒建立了仔豬免疫抑制模型。

3 添加葉酸可緩解斷奶仔豬的免疫應激

機體處于免疫應激狀態可能進一步加劇仔豬斷奶期的生長抑制，表觀地體現為生產性能急劇下降，內在地體現在豬體內養分的代謝利用受到影響。免疫應激時，養分從用于生長轉向優先滿足免疫系統代謝改變的需要。若免疫系統的活化，其中非特異性免疫反應消耗的養分為特異性免疫反應的三倍以上。在免疫抑制或者活化狀態下，仔豬對于養分的需要量及其比例模式也就和正常健康狀態有所差異。因此，重要功能性養分的額外補充一方面可以滿足免疫應激下機體的養分代謝需要，減少體內養分相對不足對于動物正常生長的影響，另一方面可以一定程度上促進免疫系統發育，協調免疫系統與其他系統的關系，調節或恢復機體免疫功能，減少或緩解免疫應激的危害。

葉酸是動物機體必需的一種水溶性維生素，在核酸合成、多種氨基酸的代謝及生物甲基化中起著重要作用。哺乳動物包括豬不能合成葉酸，其體內葉酸主要來源于食物。仔豬機體葉酸可以由飼料大宗原料、腸道微生物合成以及額外地以添加劑補充來供給。飼料大宗原料的葉酸含量本身變異很大。而且因飼料加工方法不同以及測定方法不一樣，目前資料中報道的數值差異極大。腸道微生物確實可以合成相當數量的葉酸，估計乳豬的腸道微生物就可以合成大量的葉酸。但是葉酸優選的吸收部位是空腸，吸收依賴于腸道pH值，最適pH值為5.0～6.0。因此，腸道微生物來源的葉酸能多大程度上滿足仔豬葉酸需要是有疑問的。特別是在現代化養豬場中，豬食糞來滿足它的營養需要可能性極小。

在豬上葉酸的缺乏癥狀是脫毛、毛發褪色、多種貧血癥、白細胞減少、血小板減少癥、紅細胞壓積減少和腹瀉。由于生產實踐中很多其他因素（營養、環境和疾病）都可能導致相同或相似的癥狀，因此很難判斷一些非典型的缺乏癥狀是不是由于葉酸不足而引起。而快速生長的組織器官或者更新率很高的細胞，如紅細胞、口腔和腸道上皮細胞、皮膚真皮和骨髓細胞，其生長對于葉酸水平更敏感，很容易受到葉酸水平的影響。可以推斷，斷奶階段仔豬機體相對生長很快，供給適宜和相對平穩水平的葉酸對于保障仔豬機體組織細胞正常生長也就尤為重要。飼料（食物）源葉酸可以比較平穩而均衡地滿足豬體的需要，所以研究確定和應用斷奶仔豬飼糧中添加適宜水平的葉酸具有現實意義。

關于仔豬葉酸需要量的研究結果并不一致。有研究表明，給仔豬、生長豬、育肥豬玉米-豆粕型飼糧添加葉酸200或360 μg/kg，其增重和飼料效率與不添加葉酸的豬一樣；17～27日齡斷奶仔豬玉米-豆粕-乳清粉型飼糧中添加葉酸1.1 mg/kg無有益影響。但是，Lindemann等(1986)觀察到，在相似日齡仔豬玉米-豆粕型日糧中添加葉酸0.5 mg/kg，日增重得到改善。但仔豬葉酸的需要量可能具有條件性，與仔豬的飼糧類型、藥物使用及其所處的免疫狀況可能有關。

養豬生產上考慮飼料葉酸的實際可利用程度，在仔豬飼料中普遍補充葉酸1～6mg/kg，這遠高于NRC(1998)所推薦的仔豬葉酸需要量0.3 mg/kg。而斷奶仔豬飼糧中葉酸的適宜添加劑量仍具有爭議。吮乳期機體的葉酸狀況則受乳源的影響，并隨斷奶而顯著下降。斷奶后1～3 w內，一方面仔豬往往攝食不足，易于發生腸道黏膜炎性損傷、腸道微生態惡化乃至腹瀉，這可能導致仔豬對葉酸的吸收不足而缺乏；另一方面，斷奶應激及其可能帶來的免疫抑制或免疫活化，可能會提高仔豬機體特別是免疫系統對于葉酸的需要量。有研究表明，妊娠母豬每天補充8 mg葉酸，會影響其后代仔豬斷奶時的外周淋巴細胞比例和仔豬的二次抗體應答水平。可以推斷，在斷奶前后提高仔豬飼糧的葉酸供給量會影響其機體免疫功能，可能對于提高仔豬抗病力和生產性能有積極意義。而且，藥理劑量的葉酸能夠被仔豬吸收入血液，并改變血細胞葉酸含量。這提示在斷奶仔豬飼糧中添加較高劑量的葉酸來滿足其需要和促進免疫機能既具有必要性，又具有可能性。

葉酸作為一種重要的功能性養分，與機體免疫系統的發育和機能的發揮密切相關。機體葉酸水平會影響免疫細胞的增殖和凋亡，也會影響免疫分子的表達，從而可能對機體抗病力有重要作用。Lucock(2000)詳細綜述了葉酸作為重要養分和基因之間的互作關系，及其可能介入結腸癌、冠心病等疾病進程。人群食物的葉酸狀況與包括神經管缺陷、結腸直腸癌、乳腺癌和中風等在內的一些疾病有密切關系。有報道在臨床上應用高劑量葉酸在治療或輔助治療小兒病毒性腹瀉、胃炎或胃癌、腸癌、急性淋巴白血病、高半胱氨酸血癥、抑郁癥等疾病有顯著的效果。葉酸缺乏則循環T淋巴細胞增殖活性降低，比例下降，免疫應答受到影響，機體抗感染能力下降。而在人或動物上的研究發現，葉酸水平對于組織中IL-4、IFN-α、MCP-1等細胞因子的水平有顯著影響，影響巨噬細胞產生NO，補充葉酸可促進紅細胞、CD8+等細胞的增殖，且血液高濃度葉酸具有抗氧化功能。

葉酸對于機體免疫功能及抗病力的影響日益受到重視，但目前的研究多從葉酸缺乏角度來考察其功能，對于補充葉酸以獲得機體最佳免疫力方面的研究相對不足。食物添加葉酸可能具有抗病功能，其中在影響高半胱氨酸血癥和腫瘤發生方面的研究較多，但在影響機體免疫系統發育或免疫功能方面的研究仍不充分。一些西方國家(主要是北美)，強制性地在食品中強化葉酸，而食物強化葉酸本身還具有爭議。

如上所述，仔豬在斷奶期相對生長十分迅速，免疫系統發育不完善而十分脆弱，很容易發生免疫應激和生長抑制現象。在斷奶仔豬飼糧中添加較高劑量的葉酸來滿足其需要和促進免疫機能，提高抗病力而減少病害，既具有必要性，又具有可能性。因此，我們分別以LPS和PCV-2攻毒斷奶仔豬，建立了仔豬免疫抑制和免疫激活模型，開展了飼糧添加葉酸調節機體免疫功能與抗病力的研究。

試驗研究結果表明：正常免疫狀態下，斷奶仔豬飼糧葉酸臨界缺乏可導致機體免疫細胞增殖分化不足，抗病毒能力下降，免疫系統易于被激活，生產性能下降；而飼糧中添加葉酸能顯著提高血清葉酸含量，改善生產性能，提高ADG和G/F，可以一定程度地調節機體細胞免疫和體液免疫；增進仔豬免疫細胞增殖分化，調節外周淋巴細胞亞群比例，影響血清免疫分子含量。在免疫抑制或免疫活化狀態下，仔豬飼糧葉酸臨界缺乏免疫應激危害加劇；仔豬飼糧添加適宜劑量的葉酸，會影響免疫細胞增殖分化和免疫分子分泌，可調節外周CD3+CD4+/CD3+CD8+，能增進免疫機能和緩解免疫應激的危害；可以提高生產性能，改善飼料效率。研究還發現，不同免疫狀態下，葉酸的主要效應淋巴細胞和效應免疫分子不盡相同，飼糧葉酸能發揮改善免疫機能效應的適宜水平不同，而改善生產性能的適宜劑量與增進免疫機能的適宜劑量基本一致；仔豬在免疫活化狀態下，飼糧添加葉酸的適宜劑量高于正常狀態，而在PCV-2攻擊下飼糧添加葉酸的適宜劑量低于正常狀態；隨著斷奶仔豬的生長，或免疫應激恢復期的延長，飼糧中添加葉酸的劑量應逐步下調。

4 結語

葉酸作為一種重要的功能性養分，與機體免疫系統的發育和機能的發揮密切相關。機體葉酸水平會影響免疫細胞的增殖和凋亡，也會影響免疫分子的表達，從而對動物抗病力有重要作用。仔豬在斷奶期相對生長十分迅速，免疫系統發育不完善而十分脆弱，很容易發生免疫應激和生長抑制。在斷奶仔豬飼糧中添加適宜水平的葉酸，可滿足仔豬快速生長的需要，也可促進其機體免疫機能，提高抗病力而減少PCV-2感染等病害。依據仔豬群體的不同免疫狀態，應添加不同劑量的葉酸，這對于提高仔豬免疫功能和生產性能有重要意義。