流式微球技術及量子點在實驗室診斷中的應用進展

胡曉璐，王占科

(1中國人民解放軍第94醫院，南昌330006;2南昌大學醫學院)

實驗室診斷是醫學診斷的重要內容。隨著生物化學、分子生物學、基因組學及蛋白組學的飛速發展，大量未知生物大分子不斷被發現，實驗室診斷面臨著巨大的挑戰。近年來，隨著高分子微球技術和納米量子點技術逐步用于實驗室診斷，極大地提高了診斷的靈敏度，某些極微量生物大分子可以簡便快速地被檢測出來?，F將流式微球技術及納米量子點在實驗室診斷中的應用進展情況綜述如下。

1 微球

微球是直徑為微米至納米的固體顆粒，是一種性能良好的載體，在生物分離與純化、細胞培養、臨床診斷、藥物緩釋控制等方面具有良好的應用前景。微球可由多種材料構成，如聚苯乙烯、聚多糖類、二氧化硅、聚丙烯酸脂、聚丙烯酰胺等。目前應用最廣泛的是聚苯乙烯微球［1］。聚苯乙烯微球具有機械性能好、吸附能力強、表面反應能力強、粒徑均一、單分散性能好、制備方法簡單、表面積大及表面弧度有利于抗原決定簇、抗體、核酸、菌體等結合位點的暴露而處于最佳的反應狀態，從而提高實驗室診斷的靈敏度，因此在生物化學、醫學免疫學、臨床檢驗學中得到很好的應用［2］。

免疫診斷微球是指微球偶聯特異性抗體、抗原或核酸片段的微球。偶聯抗體的微球可用于診斷相對應的抗原，偶聯抗原的微球可診斷相對應的抗體，偶聯核酸片段的微球可診斷互補核酸片段。免疫微球診斷試劑必須滿足三個要求:①微球在液體中分散性好;②微球參與的凝集反應強;③微球反應特異性強。聚苯乙烯微球疏水性強，生物大分子的疏水部位非特異性吸附在微球表面，但這種非特異性物理性吸附的作用力不夠強，因此在不影響單分散性的前提下，須對聚苯乙烯微球表面進行功能化修飾，使其表面帶有羧基、氨基等能與抗原、抗體、核酸片段進行化學鍵偶聯的官能團。功能化修飾可極大地增強結合牢固性，避免抗原、抗體、核酸片段的脫落和蛋白質交換現象。在眾多功能化修飾官能團中，表面羧基化的微球與生物分子反應活性高，應用領域最為廣泛。

2 流式微球技術(CBA)

CBA是將微球編碼技術、熒光染料標記系統、流體學、激光技術、數據分析軟件等整合在一起產生的一項新技術，該技術具有廣闊的應用前景。傳統的流式細胞術(FCM)是利用流式細胞儀對細胞或亞細胞結構進行快速分析和分選的技術。FCM與微球診斷技術相結合而產生的CBA與傳統的FCM相比，其檢測的數據和分析是通過微球表面上所攜帶的熒光信號來完成。該技術巧妙地將編碼微球的特異性與FCM的高度靈敏性相結合，可同時測定液態體系中的多種可溶性蛋白、核酸及菌體成分，可同時獲得多重信息的分析平臺，具有所需樣本量少、靈敏度高、特異性強、分析速度快、多通量同時分析等優點，其功能明顯優于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)、核糖核酸酶保護分析(RPA)等目前實驗室診斷常用的生物分析方法［3］。Horejsh等［4］以不同大小的微球作為載體，利用分子信標技術及生物素—親和素之間的特異性結合特點，在流式細胞儀上實現了對三種呼吸病原體核酸的檢測。Summerbell等［5］用該技術對DNA上的堿基進行了微編碼。李錦霞等［6］建立CBA檢測血小板特異性自身抗體的方法，發現聯合檢測血小板多種抗體可以提高檢測陽性率。王占科等［7］應用CBA與ELISA技術對人血清胰島素進行檢測，發現前者的可重復性、線性范圍、靈敏度優于后者。

CBA在小分子物質，尤其在多組分高通量同時檢測中優勢顯著。筆者所在實驗室正在研發利用CBA檢測小分子物質體系，有望建立實驗室診斷分析的技術平臺。

3 量子點(QDs)

生物體系既特殊又復雜，為了能同時測定更多的物質，對生物熒光探針有很高的要求:應當具有較好的光穩定性，不易被光解或發生光漂白;對生物體功能具有較小的影響;具有良好的激發和熒光效率;敏感性高;光譜特征突出等。目前，CBA一般都采用傳統的熒光物質，但傳統的熒光物質有較多缺陷:①激發光譜窄，發射光譜寬，具有較長的拖尾，容易造成譜峰之間的重疊。②易發生光漂白和光解現象，光解產物對生物分子具有殺傷作用，對活體細胞有一定的毒性作用。③生物分子與每種熒光染料偶聯都需要特定的偶聯方式，在高通量的生物分子的專一性的標識中有很大的局限性。近來出現的QDs成為當今國際上備受關注的嶄新的納米生物熒光探針，其克服了CBA的上述缺陷，具有很多傳統熒光物質和稀土元素不可比擬的獨特的光學性質。

QDs又稱半導體納米微晶體，其半徑≤激子波爾半徑［8，9］，粒徑為1～100 nm，多由Ⅱ～Ⅵ組和Ⅲ～Ⅴ組元素所組成，主要有CdY(Y為S、Se、Te)，還有一些復合結構以及多層結構［10］。QDs是近年發展起來的一種新型熒光探針，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米微晶體。與傳統熒光染料相比，QDs具有如下優點:①具有尺寸效應，QDs的粒徑越小，其表面積越大，表面的原子就越多，表面束縛能就越大，吸收的能量也越大，吸收光譜藍移現象越顯著，即存在量子尺寸效應。②具有較大的斯托克斯位移(激發光與反射光之間的能量差)，發射光譜狹窄且呈高斯對稱(通常半高全寬僅40 nm)，光譜之間較難重疊，可提高實驗室診斷靈敏度、特異性。QDs具有較寬的激發波長［11］，對激發光源要求不高，可以用同一激發光源同時激發多種不同顏色的QDs。③具有較高的發光效率［12］。④具有良好的生物相容性，對機體危害小，細胞毒性低，而且與生物大分子的偶聯方式相對簡單易行，不像傳統的熒光標記物，需要特定的偶聯方式［13］。⑤發光性質可以調控。相同組分的QDs材料，可以通過調節粒徑大小，獲得從藍光到近紅光幾乎所有可見波長的光。⑥光化學性質穩定性高，抗光漂白能力強，光褪色現象輕，可經過反復多次激發，不易發生熒光淬滅［14］，對生理代謝及化學物質降解均有很強的抵抗力。⑦具有靈活的表面化學、生物可塑性。

QDs經過功能化修飾，再與抗體或核酸片段耦聯形成QDs熒光探針，可用于檢測血液抗原或具有表面抗原的病原體、組織、細胞和核酸片段?；赒Ds的熒光探針和診斷系統可廣泛用于實驗室診斷，有學者［15，16］將QDs與單克隆抗體通過生物素—親和素系統形成生物素化單克隆抗體和親和素化的QDs，利用雙抗體夾心法對人血清標本中的前列腺特異性抗原進行檢測。還有學者［17，18］利用鏈霉親和素的QDs和生物素化的抗體作為探針對大腸埃希菌 O157∶H7進行檢測，與異硫氰酸熒光素(FITC)相比，具有更高的靈敏度和更好的穩定性。Hu等［19］用 CdSe的 QDs實現了對細胞癌胚抗原(CEA)的檢測。Yu等［20］用CdSe/ZnS的QDs偶聯鼠抗人甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體特異性識別AFP，QDs抗AFP抗體探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內，激光照射獲取特異性分布的腫瘤部位。QDs熒光探針技術在實驗室診斷中正發揮越來越重要的作用。

4 QDs熒光探針CBA

高性能QDs技術與CBA結合形成的QDs熒光探針CBA，為抗原、抗體、核酸片段等生物分子的實驗室檢測提供了新的方法。QDs熒光探針CBA是一種液態生物芯片技術，是一個高通量、高速率及多功能生物技術平臺，可廣泛用于免疫分析、受體和配體識別分析、酶學分析等研究，是實驗室診斷以及生命科學研究中的一大熱點。該技術的核心是對微球進行編碼和QDs熒光探針的制備。目前，對微球的編碼方式較多，有顏色編碼、阻抗編碼、粒徑尺寸編碼等。

微球熒光顏色編碼主要是用不同濃度的傳統熒光或不同粒徑不同濃度的QDs對微球進行染色編碼，形成不同顏色、不同熒光強度的微球。其工作原理主要為不同熒光顏色的微球編碼不同的待測物質，熒光微球表面攜帶熒光探針強度代表待測物質的濃度。天津大學材料學院率先將QDs技術引入微球熒光顏色編碼的液態生物芯片中，制備出不同粒徑或不同濃度的QDs熒光顏色編碼的微球和QDs熒光探針，已經用于腫瘤標記物的檢測［21］。

阻抗編碼微球CBA主要是利用阻抗作為物質的屬性，從超導體到絕緣體，阻抗作為連續變量，其阻抗信息理論上趨于無限多。微球阻抗的無限性決定著阻抗編碼微球CBA檢測通量的無限性，理論上可對微球進行無限種的編碼。筆者所在實驗室發明的微球阻抗編碼技術于2007年獲得中國知識產權，其研究正在深入進行中，已取得初步的成果［22］。

粒徑大小編碼即根據微球粒徑大小進行編碼，也可實現多通量同時檢測分析的目的。此編碼要求微球粒徑均一性好。不同粒徑的微球編碼不同的待測物質，通過流式分析，再對散點圖區域及直方圖進行統計分析，即可確認待測物質的種類及待測物質平均熒光強度值，平均熒光強度與待測物質的濃度成正比，根據標準曲線即可換算出待測物質的濃度。錢建瑞等［23］采用生物素化的羊抗兔IgG和QDs標記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了一種靈敏度高、選擇性好的檢測雌三醇的競爭免疫法。王楠等［24］采用羧基化的綠色QDs，通過羧基與禽流感單克隆抗體氨基共價結合，制備了測定禽流感病毒的QDs探針，并結合CBA，建立了QDs熒光探針CBA檢測禽流感病毒的新方法。

綜上所述，QDs與CBA快速發展，為實驗室診斷提供了新的方法。QDs熒光探針CBA所需標本量少、靈敏度高、特異性強、分析速度快、方法簡便，可多通量同時分析，在實驗室診斷中展現出了廣闊的應用前。

［1］Chang PC，Chung MC，Lei C，et al.Biocompatibility of PDGF-simvastatin double-walled PLGA(PDLLA)microspheres for dentoalveolar regeneration:a preliminary study［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100(11):2970-2978.

［2］Zhang Q，Han Y，Wang WC，et al.Preparation of fluorescent polystyrene microsphere by gradual solvent evaporation method［J］.Euro Poly J，2009，45(2):550-556.

［3］Li N，Boyd K，Dempsey PJ，et al.Non-cell autonomous expression of TNF-α-converting enzyme ADAM17 is required for normal lymphocyte development［J］.J Iumunol，2007，178(7):4214-4221.

［4］Horejsh D，Martini F，Poccia F，et al.A molecular beacon，beadbased assay for the detection of nucleic acids by flow cytometry［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(2):13.

［5］Summerbell RC，Levesque CA，Seifert KA，et al.Microcoding:the second step in DNA barcoding［J］.Philos Trans R Soc Lon B Biol Sci，2005，360(1462):1897-1903.

［6］李錦霞，楊炳華，何楊，等.流式微球技術檢測血小板特異性抗體［J］.臨床檢驗雜志，2010，28(2):110-112.

［7］王占科，何丹，祝仲珍，等.流式免疫微球技術定量檢測人血清胰島素方法學研究和評價［J］.免疫學雜志，2012，28(4):341-348.

［8］Rosenthal SJ.Bar-coding biomolecules with fluorescent nanocrystals［J］.Nat Biotechnol，2005，19(7):621-622.

［9］Dabbousi BO，Raddavanich J，Mikulec FV，et al.(CdSe)ZnS core shell quantum dots:synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites［J］.J Phys Chem，2007，101(46):9463-9466.

［10］何振宇，周培疆.量子點在生物醫學醫學檢驗中的應用及毒性研究進展［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19(12):3016-3018.

［11］Larson DR，Zipfel WR，Williams RM，et al.Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo［J］.Science，2003，300(5624):1434-1436.

［12］Dirks RW，Tanke HJ.Advances in fluorescent tracking of nucleicacids in living cells［J］.Biotechniques，2006，40(4):489-496.

［13］Zhang H，Yee D，Wang C.Quangtum dots for cancel diagnosis and thercipy:biological and clinical perspectives［J］.Nanomedicine (Lond)，2008，3(1):83-91.

［14］Wu X，Liu H，Haley KN，et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker Her 2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots［J］.Nat Biotechnol，2003，21(1):41-46.

［15］Azzazy HM，Mansour MM，Kazmierczak SC.Nanodiagnostics:a new frontier for clinical laboratory medicine［J］.Clin Chem，2006，52(7):1238-1246.

［16］Kerman K，Endo T，Tsukamoto M，et al.Quantum dot-based immunosensor for the detection of prostate-specific antigen using fluorescence microscopy［J］.Talanta，2007，71(4):1494-1499.

［17］Hahn MA，Tabb JS，Krauss TD.Detection of single bacterial pathogens with semi conduct or quantum dots［J］.Anal Chem，2005，77(15):4861-4869.

［18］Yang L，Li Y.Simultaneous detection of escherichia coli O157: H7 and salmonella typhimurium using quantum dos as fluorescence labels［J］.Analyst，2006，131(3):394-401.

［19］Hu FQ，Ran YL，Zhou Z，et al.Preparation of bioconjugates of CdTe nanocrystals for cancer marker detection［J］.Nanotechnology，2006，17(12):2972-2977.

［20］Yu X，Chen L，Li K，et al.Immunofluorescence detection with quantum dot bioconjugates for hepatoma in vivo［J］.J Biomed Opt，2007，12(1):14008.

［21］張兵波，宮曉群，李卓權，等.用于疾病診斷的GdⅢ/量子點多模態成像探針的構建［J］.高等學?；瘜W學報，2012，31(5): 982-985.

［22］Wang ZK，Hu T，Hu XL，et al.Coding by different diameter impedance，detection method of microspheres which are used to produce liquid biochip［J］.J Biosens Bioelectron，2012，3(1):111-113.

［23］錢建瑞，趙艷偉，梁艷，等.量子點標記鏈霉親和素熒光免疫分析測定雌三醇［J］.分析實驗室，2009，28(6):104-110.

［24］王楠，鄒明強，汪明，等.禽流感病毒流式微球量子點探針免疫診斷新方法［J］.分析測試學報，2009，28(7):764-768.