自身骨髓間充質干細胞及其分化的神經干/前體細胞移植治療神經系統疾病臨床觀察

任 超，劉小云，萬美榮，耿德勤，葛 巍，李金梅，張偉偉

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221002;2徐州醫學院附屬醫院)

神經細胞一旦損傷壞死、退行性變，無法自行修復［1］。目前的對癥支持、神經保護等治療療效有限。近年來用干細胞治療神經系統疾病的概念被提出［2］，尤其是骨髓間充質干細胞，其相關的動物實驗研究成果喜人，在臨床研究方面也取得了一些進展，前景誘人，但其臨床療效及安全性尚未確定。我們在神經干細胞的基礎研究方面取得了一些成果［3，4］，利用腦脊液誘導人間充質干細胞定向分化為神經前體細胞已經申請專利(專利號: ZL0810020094.3)，并于2009年11月開展了臨床應用，目前已治療神經系統疾病30例，其中隨訪滿2 a且資料齊全者有7例。現分析此7例的隨訪觀察結果。

1 資料與方法

本組7例自接受干細胞移植治療至今隨訪已滿2 a，其中男6例，女1例;年齡例1為12歲、例2為59歲、例3為41歲、例4為16歲、例5為18歲、例6為46歲、例7為12歲。病毒性腦炎致植物狀態1例，缺血缺氧性腦病致醒狀昏迷1例，遺傳性共濟失調1例，顱腦損傷后腦癱2例，急性脊髓炎1例，多發性硬化1例。納入標準:①經腦保護治療，患者生命體征平穩。②入選者均經醫院倫理委員會批準，且經患方簽署特殊治療同意書。③使用自體骨髓源干細胞治療。④隨訪滿2 a。排除標準:非自體骨髓源干細胞治療、隨訪未滿2 a及資料不全者。細胞移植治療前于患者髂后上棘穿刺抽取自體骨髓，Percoll法分離單個核細胞，進行培養，細胞經胰酶消化貼壁后，反復擴增傳代，并標記為P1～P5代。胰酶消化P5代對數生長期的骨髓間充質干細胞，DMEM/F12無血清培養基培養24 h，用患者腦脊液覆蓋細胞，72 h后每天加入腦脊液10 μL，共3 d，制備5 mL神經干細胞懸液。對誘導前的P1代細胞及誘導后6、48、72、96 h的細胞從形態學、免疫組織化學、熒光免疫組織化學等方面進行鑒定。以患者L3～4椎間隙為穿刺點，采用腰椎穿刺術鞘內注射法將鑒定的干細胞注入蛛網膜下腔。例1、2、3、6、7各注射4次，例4注射3次，例5注射1次。術后對患者進行1周的生命體征監測，詳細記錄各種不適。術后隨訪:對1例遺傳性共濟失調患者，通過世界神經病聯合會國際合作共濟失調量表(ICARS)［5］進行療效判定;對1例急性脊髓炎患者，通過國際神經修復學會脊髓損傷功能評價量表(IANR-SCIFRS)［6］進行療效判定;對1例多發性硬化患者，通過劍橋多發硬化基本量表(CMSBS)［7］進行療效判定;對2例昏迷患者，通過Glasgow昏迷量表(GCS)［8］進行療效判定;對2例腦癱患者，通過腦性癱瘓調查問卷表(CPSQ)［9］進行療效判定。

2 結果

例1:干細胞移植治療前，患者處于持續昏迷狀態1個月余，雙側瞳孔不等大(左側直徑約3 mm，右側約5 mm)，對光反射消失，雙側視乳頭水腫，雙側Babinski征陽性，肌張力下降，腱反射(－)，對疼痛刺激不敏感，GCS 4分。干細胞移植治療后1個月，患者雖仍處于昏迷狀態，但對疼痛刺激敏感程度有改善，雙側瞳孔雖不等大，但右側瞳孔直徑約恢復至4 mm，視乳頭水腫減輕，GCS 6分。3個月時查體及GCS與1個月時無明顯變化，但腦電圖及腦干聽覺誘發電位表現有所改善(移植前腦電基本節律消失，聽覺誘發電位波形難以分辨;移植后腦電圖可見少許δ波，聽覺誘發電位可見Ⅰ波)，頭顱影像學表現有好轉。6個月時患者仍處于昏迷狀態，但對于疼痛刺激敏感程度有明顯改善，雙側瞳孔等大等圓，直徑約3 mm，視乳頭水腫基本消失，GCS 8分。隨訪滿1 a時患者生命體征平穩，GCS 9分。隨訪滿2 a時患者因繼發嚴重肺部感染而死亡。

例2:干細胞移植治療前，患者處于持續昏迷狀態，雙側瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，四肢肌張力增高，腱反射(+)，雙側Babinski征(－)，疼痛刺激有屈曲逃避反應，對聲音刺激不敏感，GCS 6分。干細胞移植治療后1個月患者仍處于昏迷狀態，四肢肌張力正常，對疼痛刺激有局限反應，聲音刺激敏感性較前改善，GCS 9分，腦電圖及腦干聽覺誘發電位較治療前有改善(移植前腦電圖平為坦波形，聽覺誘發電位波形難以分辨;移植后腦電圖平坦波間見少許δ波，聽覺誘發電位可見Ⅰ波)。3個月時GCS無明顯變化，6個月時提高至10分，滿1 a時11分，滿2 a時隨訪患者因繼發嚴重肺部感染而死亡。

例3:干細胞移植治療前，患者言語不清，構音障礙，站立不穩，行走困難，平衡能力差，有運動性及意向性震顫，四肢肌肉輕度萎縮、肌力正常、肌張力增高，腱反射消失，病理征未引出，ICARS評分59分。干細胞移植治療后1個月，患者言語不清、構音障礙癥狀有明顯改善，其余癥狀改善不明顯，ICARS評分56分。3個月時肌張力增高癥狀有所好轉。6個月時運動性及意向性震顫、平衡能力等有所改善，ICARS評分51分。隨訪滿1 a時患者運動性及意向性震顫、平衡能力等繼續好轉，ICARS評分44分。隨訪滿2 a時患者癥狀、體征及ICARS評分與1 a時相比無明顯變化。

例4:干細胞移植治療前，患者四肢肌張力增高，左側偏身痛溫覺減退，左側肢體肌力2級、右上肢3級、右下肢2級，雙側Babinski征(+)，左側膝陣攣、踝陣攣陽性，CPSQ評分252分。干細胞移植后1個月，左下肢肌力3級，右下肢肌力3級，肌張力下降不明顯，CPSQ評分242分。3個月時肌張力較前有所下降，CPSQ評分無明顯變化。6個月時左上肢肌力3級，CPSQ評分232分。隨訪滿1 a時查體及CPSQ評分較6個月時無明顯變化。隨訪滿2 a時患者右上肢肌力達4級，CPSQ評分225分。

例5:干細胞移植治療前，患者雙上肢肌力4級、雙下肢2級，肌張力正常，腱反射(－)，右側Babinski征(+)，T6平面以下痛覺減退，IANR-SCIFRS評分15分。干細胞移植后1個月，患者四肢肌力無明顯變化，IANR-SCIFRS評分17分。3個月時痛覺減退平面下降至T8平面以下，IANR-SCIFRS評分19分。6個月時查體及IANR-SCIFRS評分較3個月時無明顯變化。隨訪滿1 a時患者雙下肢肌力恢復至3級，IANR-SCIFRS評分20分。隨訪滿2 a時患者痛覺減退平面下降至T11平面以下，雙上肢肌力恢復至5級，雙下肢肌力恢復至4級，大小便自控功能增強，IANR-SCIFRS評分24分。

例6:干細胞移植治療前，患者言語欠利，走路不穩，雙上肢肌力4級、雙下肢3級，肌張力增高，腱反射亢進，下頜反射(+++)，掌頜反射(+)，雙側Babinski征(+)，雙側Chaddock征(+)，CMSBS評分14分。干細胞移植后1個月，患者肌張力略有下降，CMSBS評分12分。3月時查體及CMSBS評分較1個月時無明顯變化。6個月時，雙下肢肌力達4級，CMSBS評分11分。隨訪滿1 a時雙上肢肌力達5級，CMSBS評分9分。隨訪滿2 a時查體及CMSBS評分較1 a時無明顯變化。

例7:干細胞移植治療前，患者雙下肢肌力0級，左側上肢肌力4級，腱反射(++)，雙下肢Babinski征(+)，CPSQ評分233分。干細胞移植后1個月，查體及CPSQ評分較治療前無明顯變化。3個月時雙下肢肌力1級，腱反射(+)，CPSQ評分225分。6個月時左上肢肌力達5級，CPSQ評分217分。隨訪滿1 a時雙下肢肌力達2級，CPSQ評分209分。隨訪滿2 a時查體時左側巴氏征可疑，但CPSQ評分無明顯變化。

7例患者細胞移植術后有的出現低熱，但無需特殊處理。隨訪中未見腫瘤形成等干細胞移植后可能出現的嚴重并發癥。

3 討論

骨髓間充質干細胞及其誘導分化的神經干/前體細胞的突出優點是具有自行分化和自我更新的能力，可以分化成神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞，產生更多的細胞因子如粒細胞集落刺激因子、基質細胞衍生因1、腦衍化神經營養因子、神經膠質細胞衍化營養因子等［10］。目前認為其主要通過如下機制修復神經損傷:①替代作用:Fleischman等［11］報道骨髓間充質干細胞可以向血管內皮祖細胞分化;Takahashi等［12］認為其還可向神經細胞方向分化，有利于損傷神經、血管組織的修復。Fukunaga等［13］發現，在骨髓間充質干細胞移植區內有復雜的血管形成，出現神經微絲陽性細胞，酪氨酸羥化酶(TH)染色發現帶有長樹突的神經元樣細胞，提示骨髓間充質干細胞能在成年人腦中成活，分化為成熟的中樞神經系統組織細胞，并在移植區內及其周圍形成血管。②誘導神經干細胞分化為神經元，并增加分化后神經元的存活率。③營養作用:通過分泌神經營養因子(NT)、白細胞介素類、干細胞因子等［14］，對神經功能的恢復具有促進作用。骨髓間充質干細胞還可產生對譜系發展十分重要的自分泌和旁分泌因子。另外，神經系統損傷后，各種神經因子如腦源性神經生長因子(BDNF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)、神經生長因子(NGF)、轉化生長因子β1 (TGF-β1)等在腦細胞中被誘導產生，有助于移植的骨髓間充質干細胞的存活、增殖和向病損部位遷移［15］。④橋接作用:為宿主軸突再生提供一個連接通道，讓再生的神經軸突能夠順利通過損傷處，為損傷脊髓的遠、近側殘端重新形成神經突觸聯系創造條件。⑤遷移能力:骨髓間充質干細胞具有向病變組織定向遷移和發生位點特異性分化的能力，有利于移植的骨髓間充質干細胞向受損傷部位遷移。Chen等［16］將Brdu標記的骨髓間充質干細胞移植入大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的雄性小鼠體內，14 d后神經損傷評分明顯下降，免疫組織化學染色結果顯示Brdu陽性細胞可在損傷大腦半球的多個部位出現，如皮質、紋狀體等。

臨床上已有用骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷［17］、用自體骨髓間充質干細胞鞘內注射治療多發性硬化［18］的報道。本組7例神經系統病變患者采用自體骨髓間充質干細胞及其誘導分化的神經干/前體細胞鞘內注射治療，也取得了明顯療效，未見腫瘤形成等干細胞移植可能并發癥。說明該方法治療中樞神經系統疾病安全、有一定療效。但觀察病例數少，疾病的針對性也比較有限。要得到確切結論，尚需大宗病例的應用和觀察。

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