胰島素對心肌缺血/再灌注損傷兔心肌組織中髓過氧化物酶活性的影響及意義

吳 峰，王國坤，倪飛華，馮金忠，邱一華，李 嘉，張海峰，高 峰，秦永文

(1第二軍醫大學附屬長海醫院，上海200433;2第四軍醫大學; 3解放軍第九八醫院)

心肌梗死與炎癥反應密切相關，缺血/再灌注(MI/R)后心肌組織可出現較前損傷加重的情況，目前研究認為可能是循環血中的中性粒細胞(PMN)向血管內皮黏附，并最終遷移和聚集在缺血的心肌組織中，活化的PMN可釋放大量的毒性物質，如H2O2、超氧陰離子及酶類物質等，從而加劇了心肌缺血再灌注(MI/R)［1，2］。胰島素在臨床危重癥患者中應用后能夠明顯降低其敗血癥和膿毒血癥的發生率［3］，研究［4］提示，胰島素可能存在重要的抗炎作用。結合我們2008年以來的研究工作［5］，近期我們又觀察了胰島素是否能夠通過抑制PMN在心肌組織中聚集而減輕局部及全身炎癥反應，達到保護MI/R心肌的作用。髓過氧化物酶(MPO)活性是反應PMN聚集、浸潤程度的重要指標，本研究通過檢測心肌組織中的MPO活性反應PMN在局部心肌組織的浸潤情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康新西蘭大白兔(40只，由第二軍醫大學實驗動物中心提供)，雄性，體質量2.5～3.0 kg。胰島素為諾和諾德公司產品;肌酸激酶同工酶(CK-MB)、MPO、高敏C反應蛋白(hs-CRP)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;伊文氏藍和氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma公司。

1.2 模型制備和實驗方案 用3%戊巴比妥鈉行兔耳緣靜脈注射麻醉(1 mL/kg)，心電圖監測。切開實驗兔皮膚，沿胸骨左緣開胸，剪開心包，暴露心臟，以無創針帶單絲線在冠狀動脈(冠脈)左旋支(LCX)中部穿過，線兩端共套一聚乙烯管，形成閉合環，拉緊絲線，鉗夾聚乙烯管即阻斷LCX前向血流，心臟表面可見青紫，心電圖出現ST段上升，松開閉環后心肌獲得再灌注，青紫可減輕。出現以上情況認為結扎成功。缺血15 min后進行以下處理:將40只兔隨機分為4組，各10只。假手術組:絲線通過冠脈后不收緊聚乙烯管(即不形成缺血);GIK組:通過另一側耳緣靜脈輸注葡萄糖250 g/L+胰島素60 U/L+氯化鉀 60 mmol/L，4 mL/(kg·h);GK組:通過另一側耳緣靜脈輸注葡萄糖250 g/L+氯化鉀60 mmol/L，4 mL/(kg·h);對照組:通過另一側耳緣靜脈輸注0.9%NaCl，4 mL/(kg·h)。本實驗中，實驗兔行缺血45 min、再灌注6 h處理。

1.3 各組血漿CK-MB活力和hs-CRP測定 于再灌注6 h時取各組兔動脈血(2 mL)，靜置后4℃離心(2 500×g)10 min，采用分光光度法檢測血漿CK-MB、hs-CRP。具體操作根據試劑盒說明書進行。

1.4 心肌梗死范圍測定 實驗兔再灌注6 h結束后，再次拉緊絲線，結扎LCX，并向左心室腔內注入50 mL的2%伊文氏藍，立即取出心臟，－20℃凍存至心臟呈固體硬塊狀。垂直于心臟長軸將其切成約2 mm厚的薄片，單片置于含1%TTC(pH 7.4)2 mL的12孔培養皿中，37℃孵育15 min。用數碼相機拍照，圖像表現為伊文藍染色區(非缺血區)、TTC染色區(紅染，缺血但仍存活組織)以及非TTC染色區(梗死心肌)，將圖像輸入計算機，用SigmaScan面積測算軟件進行計算分析。心肌梗死范圍以每一心臟總梗死面積(INF)占總缺血區面積(AAR)的百分比表示。

1.5 心肌組織中MPO活性測定 心臟組織稱重后，按質量體積比1∶19加勻漿遞質制成5%的勻漿液，隨后加入H2O2和顯色劑，水浴后立即在分光光度計460 nm處測定吸光度值(A值)。MPO活性以37℃反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個活力單位。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。組間數據比較用單因素方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以SNK-q檢驗分析相應兩組間的差異。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿CK-MB活性比較 GIK組、GK組、對照組、假手術組血漿CK-MB活性分別為(32.3± 2.8)、(120.2±11.4)、(89.5±11.1)、(123.5± 17.7)U/L;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.2 各組心肌梗死面積比較 GIK組心肌梗死范圍為35.7%±2.7%、GK組為49.4%±2.6%、對照組為48.6%±3.2%、假手術組為9.2%±2.1%; GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.3 各組心肌組織MPO活性比較 GIK組、GK組、對照組、假手術組MPO活性分別為(0.64± 0.12)、(1.05±0.14)、(1.15±0.16)、(0.21± 0.06)U;與假手術組相比，對照組MPO活性升高近6倍，兩組相比，P＜0.01;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.4 各組血漿hs-CRP水平比較 GIK組、GK組、對照組、假手術組hs-CRP分別為(6.98±0.91)、(10.23±1.24)、(10.98±1.08)、(2.07±0.48) mg/L;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

3 討論

研究［6］發現，胰島素不僅具有調節糖、脂肪等各種營養物質代謝的作用，還具有穩定內皮細胞、抗炎和抗動脈粥樣硬化等效應。關于胰島素在MI/R中的作用機制，傳統觀點認為胰島素通過代謝機制促進心肌細胞對葡萄糖的攝取和更有效的利用，增加缺血心肌的能量供應，間接發揮保護受損心肌的作用。研究［7］發現，胰島素主要通過磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶—內皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)途徑來激活細胞內的“生存信號”，從而減少心肌細胞的凋亡和壞死。同時，臨床試驗顯示，在危重病患者中強化胰島素治療能夠明顯降低患者膿毒血癥和敗血癥的發生率［8］。Chaudhuri等［9］發現，對急性ST段抬高的心肌梗死患者，胰島素強化治療能夠同時降低血漿C-反應蛋白和淀粉酶A的水平。

心肌組織發生缺氧、壞死后引起炎性反應，釋放活性分子和化學因子，同時表達內皮細胞黏附分子，促使PMN與心臟冠脈內皮細胞發生黏附，并滲透血管內皮在心臟受損組織中聚集，最終將釋放大量的活性氧自由基和分泌各種水解酶類，直接對心臟組織造成損害［2，3］。其中，PMN在心臟局部的黏附和浸潤是炎癥反應的起始，亦是隨后發生炎性損傷的重要過程，對這一反應的抑制將會減輕MI/R過程中的炎性損傷。鑒于MPO是PMN激活后釋放的一種主要酶類，其可以作為反映局部PMN活性的一個標志。在本研究中，我們觀察到進行胰島素干預治療后可降低MI/R兔心肌組織MPO活性，即減少PMN在受損心肌組織中的浸潤、積聚。通過抑制PMN積聚使CK-MB水平下降、心肌梗死面積減小，這可能是胰島素發揮心臟保護作用的途徑之一。

［1］Yoshizaki T，Umetani K，Ino Y，et al.Activated inflammation is related to the incidence of atrial fibrillation in patients with acute myocardial infarction［J］.Intern Med，2012，51(12):1467-1471.

［2］Lee WW，Marinelli B，van der Laan AM，et al.PET/MRI of inflammation in myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59(2):153-163.

［3］Arabi YM，Dehbi M，Rishu AH，et al.sRAGE in diabetic and nondiabetic critically ill patients:effects of intensive insulin therapy［J］.Crit Care，2011，15(4):203.

［4］Dandona P，Ghanim H，Bandyopadhyay A，et al.Insulin suppresses endotoxin-induced oxidative，nitrosative，and inflammatory stress in humans［J］.Diabetes Care，2010，33(11):2416-2423.

［5］Li J，Zhang H，Wu F，et al.Insulin inhibits tumor necrosis factoralpha induction in myocardial ischemia/reperfusion:role of Akt and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation［J］.Crit Care Med，2008，36(5):1551-1558.

［6］Dandona P，Chaudhuri A，Ghanim H.Acute myocardial infarction，hyperglycemia，and insulin［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53(16): 1437-1439.

［7］Ma H，Zhang HF，Yu L，et al.Vasculoprotective effect of insulin in the ischemic/reperfused canine heart:role of Akt-stimulated NO production［J］.Cardiovasc Res，2006，69(1):57-65.

［8］van den Berghe G，Wouters PJ，Kesteloot K，et al.Analysis of healthcare resource utilization with intensive insulin therapy in critically ill patients［J］.Crit Care Med，2006，34(3):612-616.

［9］Chaudhuri A，Janicke D，Wilson MF，et al.Anti-inflammatory and profibrinolytic effect of insulin in acute ST-segment-elevation myocardial infarction［J］.Circulation，2004，109(7):849-854.