芥菜籽抑制Ⅰ型超敏反應的實驗研究

汶春苗，楊閏平，梅寧菊，董 亞，李恒進，趙 華

1解放軍總醫(yī)院 皮膚科，北京 100853；2西寧市第一人民醫(yī)院 皮膚科，西寧 810000；3涿州市醫(yī)院皮膚科，涿州 072750

I型超敏反應又稱過敏反應或速發(fā)型超敏反應，主要由特異性IgE抗體介導，可發(fā)生于局部或全身，是臨床最常見的一種超敏反應，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。芥菜籽(mustard seed，MS)又名芥子，是十字花科蕓苔屬植物芥菜的種子，其種類有黑芥籽、黃芥籽和白芥籽。《中國藥典》記載：芥菜籽具有溫肺豁痰利氣，散結(jié)通絡止痛的功效，用于寒痰喘咳，胸脅脹滿，痰滯經(jīng)絡關(guān)節(jié)麻木，疼痛，痰濕流注，陰疽腫毒等癥[1]。目前研究證明芥菜籽具有抗菌、抗輻射、抑制前列腺增生、防癌抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[2-7]。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽能夠抑制小鼠Ⅳ型超敏反應(文章待發(fā))，但是否對Ⅰ型超敏反應有影響尚不清楚。本研究通過組胺、卵白蛋白(ovalbumin)等誘發(fā)小鼠I型超敏反應模型，探討芥菜籽對I型超敏反應的作用。

材料和方法

1 實驗動物 雌性Balb/c小鼠58只，5周齡，15-17g，SPF級(購自北京維通利華公司，合格證號：SCXK京2009-0007)。隨機分為模型組(26只)、5%芥菜籽組(26只)，正常組(6只)。模型組和正常組給予普通飼料、芥菜籽組給予含5%芥菜籽飼料，喂養(yǎng)3周后，再進行實驗。飼養(yǎng)環(huán)境：動物房保持通風、干燥，室溫22-25℃，濕度50%-70%，自由飲水和飲食。

2 試劑與儀器 5%芥菜籽飼料(南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供)；0.1%組胺溶液(由阿羅格公司提供)，Compound 48/80(SIGMA公司，產(chǎn)品批號：040M4047)，伊文思藍(SIGMA公司，產(chǎn)品批號：MKBD9146V)，丙酮(國藥集團化學試劑公司，產(chǎn)品批號：20081108)。卵白蛋白(SIGMA公司，產(chǎn)品批號：040M7001V)，氫氧化鋁(國藥集團化學試劑公司，產(chǎn)品批號：20090327)，IL-4、IgE、IFN-γELISA試劑盒(北京嘉美生物公司)。721B型分光光度計(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))，0.8cm打孔器，低溫高速離心機(德國HERAEUS生產(chǎn))，酶標儀(SIGMA公司)，DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)。

3 小鼠毛細血管通透性增高模型制備 1)用組胺建模：喂養(yǎng)3周后，取模型組和芥菜籽組小鼠各10只。按照參考文獻[8]所述方法并加以改進，實驗前1天，各組小鼠背部剃毛4cm×4cm。實驗當天，于脫毛處皮內(nèi)注射0.1%組胺溶液0.05ml/只，形成一小皮丘，同時立即尾靜脈注射0.5%伊文思藍溶液(0.05ml/10g)，30min后脫頸處死小鼠，迅速翻轉(zhuǎn)背部皮膚，測量藍斑的最長徑(D)及中點垂直徑(d)，剪下藍斑皮膚，用直徑0.8cm打孔器打下1塊皮片，剪碎后置于4ml丙酮-0.9%氯化鈉注射液(7∶3)溶液中，在37℃恒溫水浴鍋中浸泡24h后，以3 000r/min離心，取上清液于721B型分光光度計波長610nm處測光密度(OD值)，參考文獻[9]所述，按以下公式計算藍斑面積：S=3×[(D+d)/4]2，D=藍斑最長徑，d=中點垂直徑。2)用Compound 48/80建模：喂養(yǎng)3周后，取模型組和芥菜籽組小鼠各10只。按照參考文獻[10]所述方法，Compound 48/80用蒸餾水稀釋后皮內(nèi)注射于小鼠背部脫毛處(0.5μg/20μl)，其余方法同上。

4 小鼠全身Ⅰ型超敏反應模型制備 按照參考文獻[11]所述方法，具體分組如下：1)模型組(6只)：以0.9%氯化鈉注射液配制氫氧化鋁混懸液(1g/L)，每只腹腔注射0.2ml的卵白蛋白(OVA 0.1mg)與AL(OH)3溶液(1g/L)的混合液進行初次免疫，第10天重復1次；2)芥菜籽組(6只)：處理同上；3)正常組(6只)：不予任何處理。第14天摘眼球取血，放置4℃冰箱，24h后在4℃下離心5min，12 000r/min，分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩LISA檢測嚴格按照IgE，IL-4和IFN-γELISA試劑盒操作說明進行。

5 統(tǒng)計學方法 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所測數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠毛細血管通透性比較 小鼠尾靜脈注射伊文思藍后，背部被動致敏部位的皮膚明顯藍染，而未致敏部位的皮膚顏色正常。模型組小鼠的藍斑面積較大，芥菜籽組的藍斑面積相對較小(P<0.05)。兩組所測的藍斑OD值有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

2 芥菜籽對小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ的影響 ELISA血清結(jié)果顯示模型組的IgE、IL-4水平相比正常組都有明顯升高(P<0.01)，但與芥菜籽組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組的IFN-γ水平相比正常組明顯降低(P<0.01)，但與芥菜籽組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 芥菜籽對組胺及compound 48/80致小鼠毛細血管通透性增高的影響Tab 1 Effect of mustard seeds on histamine and compound 48/80-induced capillary permeability in mice (±s, cm2)

表1 芥菜籽對組胺及compound 48/80致小鼠毛細血管通透性增高的影響Tab 1 Effect of mustard seeds on histamine and compound 48/80-induced capillary permeability in mice (±s, cm2)

aP<0.05, vs model group

ceruleus OD Area of Locusceruleus OD Model 3.290±0.462 0.187±0.04 1.388±0.351 0.190±0.038 MS 2.521±0.314a0.137±0.06a 0.763±0.381a0.128±0.036a Group (n=10) Histamine Compound 48/80 Area of Locus

表2 芥菜籽對小鼠全身Ⅰ型超敏反應血清細胞因子的影響Tab 2 Effect of mustard seeds on serum IgE, IL-4 and IFN-γ levels in mice with systemic typeⅠhypersensitivity (±s, pg/ml)

表2 芥菜籽對小鼠全身Ⅰ型超敏反應血清細胞因子的影響Tab 2 Effect of mustard seeds on serum IgE, IL-4 and IFN-γ levels in mice with systemic typeⅠhypersensitivity (±s, pg/ml)

aP<0.05, vs normal group; bP>0.05, vs model group

MS 7.133±1.112b 2.40±0.61b 2.56±0.45b Model 8.048±0.941a 2.98±0.58a 2.01±0.74a Normal 2.585±0.594 0.81±0.31 5.93±0.99

討 論

蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫等皮膚黏膜過敏性疾病是皮膚科常見的Ⅰ型超敏反應，其主要發(fā)病機制是由特異性IgE抗體介導，肥大細胞、嗜堿粒細胞和嗜酸粒細胞等效應細胞以釋放生物活性介質(zhì)的方式參與發(fā)生[12]，其中組胺、5-羥色胺、白三烯等作為細胞顆粒內(nèi)預先儲備的介質(zhì)和脫顆粒過程中新合成的介質(zhì)被釋放出來后具有多種生物活性。組胺可使毛細血管擴張、平滑肌收縮、腺體分泌增加。Compound 48/80作為一常用的肥大細胞介質(zhì)釋放劑，通過增加GTPγS結(jié)合G蛋白的幾率激活肥大細胞的分泌過程[13]，最終引起組胺、5-羥色胺等介質(zhì)釋放，從而引起過敏反應。本實驗結(jié)果顯示，模型組和芥菜籽的藍斑面積和吸光度都有差別，模型組顯著大于芥菜籽組，說明芥菜籽可以抑制局部的超敏反應。

正常情況下血清中總IgE抗體含量很低，而發(fā)生Ⅰ型超敏反應時，IgE抗體含量則顯著增高，故在該類疾病治療中，主要以抑制IgE產(chǎn)生為目的[14]。目前的研究認為Thl/Th2細胞亞群失衡在Ⅰ型超敏反應的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用，即Th2細胞優(yōu)勢免疫模式。IFN-γ和IL-4分別是Thl和Th2代表性的細胞因子。Th1和Th2細胞均能調(diào)控IgE的合成，二者失衡導致IgE產(chǎn)生失控而增多，與Ⅰ型超敏反應的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中，通過ELISA法測外周血中的IgE、IFN-γ和IL-4，發(fā)現(xiàn)模型組和正常組間差異有統(tǒng)計學意義，符合Ⅰ型超敏反應疾病的血清學變化趨勢。但模型組和芥菜籽組間的差異無統(tǒng)計學意義，可能與研究樣本量少，無法正確反應血清學的變化趨勢有關(guān)；另外也可能是芥菜籽不能通過影響細胞因子來抑制過敏反應。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)芥菜籽能夠抑制皮膚局部的超敏反應，這一點與李小莉的研究結(jié)果一致[6]，但對全身超敏反應無明顯影響。

1 國家藥典委員會. 中國藥典（一部）［M］. 北京：化學工業(yè)出版社，2005：134.

2 呂紹杰. 日本開發(fā)芥子提取物制劑用于抗菌作用的概況［J］.中國食品用化學品，1998，15（4）：26-27.

3 李群，郭房林，顧瑞琦. 果蠅伴性隱性致死突變試驗中白芥子堿的輻射保護作用［J］. 實驗生物學報，1993，26（3）：259-274.

4 吳國欣，林躍鑫，歐敏銳，等. 白芥子提取物抑制前列腺增生的實驗研究（Ⅱ）［J］. 中國中藥雜志，2003，28（7）：643-646.

5 Eskin NA，Raju J，Bird RP. Novel mucilage fraction of Sinapis alba L. （mustard） reduces azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci formation in F344 and Zucker obese rats［J］. Phytomedicine，2007，14（7-8）：479-485.

6 李小莉，張迎慶，黃通華. 白芥子提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，，2007，21（6）：28-30.

7 袁海峰，郭文，朱明古，等. 芥菜籽對氧化偶氮甲烷誘導小鼠結(jié)直腸癌的影響［J］.中國癌癥雜志，2010，20（3）：178-181.

8 Squaiella CC，Longhini AL，Braga EG，et al. Modulation of the type I hypersensitivity late phase reaction to OVA by Propionibacterium acnes-soluble polysaccharide［J］. Immunol Lett，2008，121（2）：157-166.

9 蔣萍，閆玉蘭，張宏謄. 點刺皮膚試驗的組胺陽性對照及臨床意義［J］. 中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（S2）：79-81.

10 Choi YH，Chai OH，Han EH，et al. Lipoic acid suppresses compound 48/80-induced anaphylaxis-like reaction［J］. Anat Cell Biol，2010，43（4）：317-324.

11 唐建民，張鳳蘊，高淑英，等. 息敏膠囊對Ⅰ型超敏反應模型鼠IgE、IL-4及IFN-γ水平的影響［J］. 細胞與分子免疫學雜志，2003，19（6）：616-617.

12 陳慰峰. 醫(yī)學免疫學［M］. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：191-193.

13 Palom?ki VA，Laitinen JT. The basic secretagogue compound 48/80 activates G proteins indirectly via stimulation of phospholipase D-lysophosphatidic acid receptor axis and 5-HT1A receptors in rat brain sections［J］. Br J Pharmacol，2006，147（6）：596-606.

14 李忻紅，王惠國，關(guān)洪全. 消敏顆粒對Ⅰ型超敏反應模型大鼠血清IgE含量及脾細胞IFN-γ mRNA，IL-4 mRNA表達的影響［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：970-971.