單核苷酸多態性與舒尼替尼一線治療進展期腎細胞癌患者的療效、不良反應的相關性分析：一個多中心、觀察、前瞻性研究（譯文）

海南省人民醫院泌尿外科 王忠堯 康新立

舒尼替尼是一個口服的酪氨酸激酶受體抑制劑，它的作用靶點是血管內皮生長因子（VEGF）受體、血小板源性生長因子、KIT、FLT-3、克隆刺激因子-1受體以及RET在一個隨機的3期研究中，與一線治療藥物干擾素-a比較，舒尼替尼治療進展性透明細胞腎癌，可顯著改善無進展生存（PFS），5個月 vs 11個月，（P＜0.001），舒尼替尼已經成為當前腎癌標準治療的選擇。這些發現是有一些研究數據支持的，有研究顯示舒尼替尼可能對總體生存（OS），有改善作用（干擾素-a vs 舒尼替尼=21.8個月vs 26.4個月，P=0.051），一個全球擴大性的超過4 500例患者參與的研究也得到了同樣的結果。然而一些警告仍然存在，盡管大多數患者使用舒尼替尼可使疾病可控，但仍有20％的患者早期發生疾病進展和不良反應，導致8％的患者劑量保持不變，32％減量，38％發生推后使用藥物。因為藥物的暴露與藥效有關，不良反應盡管不影響生命質量但是引起藥物劑量的調整，劑量的調整會危及（或影響）藥物的治療效果 。確定舒尼替尼耐藥或不良反應發生風險的相關性生物標記物能夠有助于找出新的治療方法并能提高治療效果，盡管目前提出了多種藥物耐藥的不同機制，但是患者的遺傳學背景仍發揮重要的作用，特別是舒尼替尼之類藥物，不僅僅是直接的細胞毒性活性，它不僅與腫瘤的微環境有相互作用，而且與非惡性的內皮細胞相互作用。最近報道，高血壓可作為舒尼替尼治療效果可靠的生物標記，這一事實證實了這一假說即：舒尼替尼治療的敏感性和藥物耐藥機制可能至少一部分是宿主依賴性的 。

因此本研究的目的就是確定舒尼替尼作為透明細胞腎癌的一線治療藥物時，影響藥物治療反應和不良反應相關的藥代和藥動有關的SNPs。

1 資料和方法

1.1 研究設計和患者選擇

在西班牙生殖泌尿腫瘤中心所屬的15個醫院進行了觀察、前瞻性研究，患者為成人（大于等于18歲）病理學診斷確診是腎臟透明細胞癌，有局部和遠處轉移的患者，入組條件：患者之前沒有接受過任何系統性治療，包括細胞因子治療，按照每日臨床情況，接受有計劃的舒尼替尼治療。治療方案是經過所有參與本研究或機構的醫學倫理委員會審核并通過的，所有患者簽署了知情同意書。

1.2 步驟

藥物治療時間表，藥物劑量減量規則，以及放射學評估的時間均由參與研究的臨床醫生根據目前當地執行的臨床指南來決定和制定。以特定的病例記錄格式記錄患者的人口學以及臨床數據，該數據定期會有外部的監察員進行綜合審查。患者樣本進行2次匿名審查，一次是參與研究的醫生，一次是西班牙國家腫瘤研究中心，進行分子生物學分析的研究者不知道患者的臨床信息。

本研究檢測了可能與舒尼替尼作用、代謝、以及轉運有潛在關系的9個基因中的16個SNP，選擇這些SNP多態性是基于之前的研究證據，之前報道的相關性：例如這些多態性會導致氨基酸變化以及不成熟等位基因發生率超過5％ 。這些被選擇的可能影響舒尼替尼的藥物動力學的多態性是位于編碼舒尼替尼靶點和配體的基因上：包括[VEGFR2（rs2305948和rs1870377），VEGFR3（rs307826，rs448012和rs307821），PDGFR-a （rs35597368），VEGF-A（rs2010963，rs699947和rs1570360），IL8（rs1126647）]，這些SNP中的其中6個是受體中公認的功能性錯義多態性，其中3個SNPs是之前報道的與貝伐單抗治療反應以及腫瘤進展相關的（VEGF-A 5端非翻譯區 和啟動子變異體），1個是之前研究過的與帕唑帕尼治療腎癌對PFS影響相關的SNP（是IL-8 3端非翻譯區變異體），可能影響舒尼替尼的藥物動力學的多態性位于與其代謝相關的基因上[CYP3A4（rs2740574）和CYP3A5（rs776746）和轉錄子ABCB1（rs1045642，rs1128503和rs2032582）和 ABCG2（rs2231142）]，CYP3A5*1是一個高度活躍的等位基因，然而CYP3A4中的SNP是舒尼替尼的主要代謝酶，是啟動子變異體，但與已發表的報道其活性的結果相反。由于是轉運子，已經報道ABCG2變異體增加了舒尼替尼的暴露率，曾有多個研究重復報道3個ABCB1的SNPs與可變性P-糖化蛋白的活性有關。

使用FlexiGene DNA試劑盒提取外周血DNA （廠家：Qiagen,Valencia,CA,USA），唾液中的DNA 提取使用DNA試劑盒（DNA GenotekOttawa,ON,Canada），根據生產廠家推薦的操作步驟進行,使用picogreen定量DNA 終濃度（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），使用KASPar SNP基因分析系統 對SNP進行分型（Kbiosciences,Hoddesdon,UK），使用7900HT序列檢測系統（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）進行熒光檢測和等位基因分配。

1.3 統計學分析

無進展生存（PFS）定義：時間計算是從舒尼替尼開始治療的第一天到放射學疾病進展、明確的臨床進展、或死亡之間的時間，患者在數據關閉時還未發生疾病進展的要在最后隨訪時進行審查。如果不能確定疾病進展的日期，在最后一次腫瘤評估時審查患者的PFS。總體生存（OS）定義：計算舒尼替尼開始治療的第一天到患者死亡或者最后一次隨訪的日之間的時間。客觀反應率由治療的醫生依據實體腫瘤治療效果評估標準（RECIST） 1.0版本進行，分為：完全應答、部分應答、穩定、或疾病進展。評估的時間由各個臨床研究中心確定，根據不良反應常見中終止標準的3.0版本（參考 webappendix p 1），參加治療的醫生對所有不良反應進行評估定級，以臨床相關性以及分級的客觀性為基礎，結合3～4級不良反應，選擇口腔黏膜炎，手足綜合癥，高血壓，貧血，以及血小板減少等進行不良反應分析，同時也記錄了因藥物不良反應而引起藥物減量以及發生的時間。

使用COX-回歸分析檢測了對應PFS和OS的SNP的基因型，使用logistic回歸分析檢測了對應RECIST反應的SNP的基因型，使用多參數分析法分析了包括PFS，OS，反應率等作為協變量與各種臨床因素的相關性分析（與特定變量相關性是P＜0.1的臨床因素就可作為那個特定變量的協變量），根據MSKCC預后分類以及多變量分析中的變量，我們將患者分為預后良好、中等、預后差三組，沒有將參加研究的中心作為協變量，因為患者的數目在所有15個臨床研究中心都比較少，都小于等于17，使用kaplan-Meier 方法以多參數分析法進一步分析了SNPs與PFS以及OS 的相關性。

使用舒尼替尼治療天數（計算直到減少劑量）為變量的 COX回歸模型，分析了與因藥物毒性引起舒尼替尼減量的風險增加相關的基因型分析，不減量的患者在最后一次隨訪時進行審查，對于多參數分析，使用相關性P＜0.1的臨床因素與劑量減少作為協變量，使用Kaplan-Meier法進一步在多參數分析中分析SNP與舒尼替尼減量的相關性 ，對所有患者以及起始劑量為50mg 組的患者做了此分析。以藥物的不良反應進展作為次要終點，應用logistic回歸分析研究了特定的舒尼替尼不良反應與基因型之間的相關性。多參數logistic回歸分析包括相應結果作為協變量與臨床因素之間的相關性分析（臨床因素相關性P＜0.1）。我們使用更多的遺傳模型檢測所有基因類型。

保留缺失的數據作為MSKCC（紀念斯隆-凱特琳癌癥中心）預后因素的缺失部分，剩下的一系列數據，最可能的價值是被分配到這些患者，使用Bonferroni方法糾正多重檢驗誤差。對16個多態性進行分析，僅有在95％可信水平不經過矯正P＜0.0031被認為是有統計學意義。

所有的統計學分析使用 RStudion 的0.93版本進行。

1.4 資金資助的作用

研究的申請者不參與研究資料收集、分析、資料解釋以及報告撰寫。JG-D，LJL-G和CR-A可以接觸到原始數據，JG-D、LJL-G、DEC和CR-A負責決定研究結果的提交發表。

2 結果

時間從2007年10月10日至2010年12月10日，募集患者共101例，關閉隨訪資料在2011年5月。剔除了6例患者，其中3例患者不能提供血液和唾液標本，2個不是透明細胞腎癌，1個是未接受舒尼替尼治療。確定6個惡性腎臟腫瘤存在于6個其他患者中，但是亞型未確定，在舒尼替尼療效分析中排除了這幾個腫瘤患者（如包括89例患者），但是在不良反應分析中包括這6例患者（95例患者）。表1列出的是入選患者的臨床特征，66個（69％）患者有多處轉移，在白人中16個基因多態性分型的次要等位基因頻率與其他報道的很相似，所有的SNPS是哈迪-溫伯格（hardy-weinberg）平衡。

需要分配的變量 MSKCC 評分在18例患者中缺失（11例患者基線鈣濃度，6例患者狀態評分，1例乳酸脫氫酶濃度），一些患者盡管缺少一些資料，但是仍然能正確的被分配到 MSKCC 組，經過計算這些患者的最可能的值，15例患者分配到預后良好組，3例分配到預后中等組，替代或沒有替代這些缺失信息所得到的結果是相當的，說明替代并沒有使研究結果偏離。92（97％）的患者被劃分為MSKCC風險評估中等和良好組（見表1）。94例患者是西班牙白種人，1例是非洲后裔，1例是亞洲（印度）后裔。

在經過中位21.2個月的隨訪（IQR8.4～25.6，95％CI 13.6～28.9），89例進行療效分析的患者中，中位PFS是12.3個月（IQR 5.8～21.2,95％ CI 9.1～15.4），62例患者（72％）在進行分析時仍存活，在78例可測定疾病的患者中進行總體治療反應評估，1例（1％）完全應答，36例（46％）部分應答，26例（33％）穩定，15例（19％）疾病進展。

在毒性分析中，最常見的1～3級不良反應是乏力67例（71％，67/95），黏膜炎 64例（67％），腹瀉49例（52％），中性粒細胞減少 40例（42％），手足綜合癥 39例（41％），43例（45％）的患者發展成3級不良反應，47例（49％）因不良反應需要減量。沒有報道4級不良反應。

與低評分和男性患者比，MSKCC高危因素評分高以及婦女患者的總體生存率和總體反應率差，但是PFS無差異 （webappendix p2），女性患者需要劑量減少的風險性更高，因為不良反應的發生率高于男性（P=0.005webappendix p3）。

表3顯示，使用多參數COX回歸分析了16個多態基因型的結果。2個VEGF3的多態性rs307826和rs307821，與PFS顯著相關（見圖1和表3），這個相關性在多重檢驗經過Bonferroni 校正后仍然有顯著相關性，這些VEGFR3的多態性是，中等連鎖不平衡是錯義變異體（r2=0.55），很少有患者獨立攜帶這些變異，這樣，我們構建的模型表明根據這2個多態性基因型對患者PFS進行分組（webappendix p5），盡管在 P＜0.5的水平無統計學意義，但具有其他3個ABCB1、ABCG2和VEGFR2 （rs1128503、rs2231142和rs1870377） 的多態性的患者，舒尼替尼治療反應PFS 或OS 相對差（見表3）。

表1 患者的臨床特點

50例舒尼替尼藥物減量的患者中47例（94％）是由于不良反應（webappendix P1）。為了檢測與減量相關的因素，本研究分析了84例患者計算了從使用起始劑量為50mg到因為不良反應減量的時間。結果女性患者較男性更早減少劑量（P=0.005），并且多參數分析表明 CYP3A5 rs776746是重要的危險因素 （見圖2和表4），并且經過多重檢驗后相關性仍具顯著性。對所有95例患者重復進行了該分析，得到了相似的結果（資料未顯示），三個變異等位基因（VEGFR2 rs1870377、VEGF-Ars699947和rs1570360）與高血壓（見表4）發生風險增加可能成顯著相關性，而2個ABCB1 rs1128503和rs2032582成保護作用，VEGFR2 RS2305948可能與發生手足綜合癥的風險相關，ABCG2 rs2231142起保護作用，VEGF-A rs2010963可能與黏膜保護相關，然而經過多重檢驗校正后這些相關性無統計學意義（見表4）。

圖1 對比舒尼替尼治療后的腎癌患者VEGFR3中rs307826和rs307821位點變異型的無進展生存期的Kaplan-Meier曲線分析

3 討論

本前瞻性研究對SNPs作為評估舒尼替尼作為之前未做任何治療的透明細胞腎細胞癌的一線治療藥物的療效和毒性的預測因素進行了研究，該研究顯示2個VEGFR3的錯義多態性與PFS縮短有顯著的相關性，其中CYP3A5的一個功能性多態性與舒尼替尼因不良反應劑量減少的風險增加有關。這些相關性盡管未在獨立的機構進行確認，但是多個檢驗糾正后仍有統計學意義。這些數據表明應該提高針對這些有遺傳學變異的腎癌患者的個性化治療方法。

治療腎癌可供選擇的藥物越來越多，包括4個已經批準上市的抗血管生成藥物（所拉菲尼、舒尼替尼、貝伐單抗和帕唑帕尼）以及3個其他類別的處于研發后階段的藥物（阿西替尼、tivozanib、多維替尼）以及多種mTOR抑制劑。確定此類藥物療效和不良反應相關的生物學標志物的是推進藥物發展和提高患者治療質量的重要一步，因此，研究目的是確定影響舒尼替尼治療效果，是否可作為潛在的生物學標志物生物多態性，此多態性主要集中在改變舒尼替尼的藥物代謝和藥物動力學的遺傳學變異體（見表2）。本研究發現VEGFR3和CYP3A5的多態性可以解釋在一些患者中使用舒尼替尼無效或低耐受性。

表2 多態性的基因型和等位基因頻率

表3 舒尼替尼治療腎細胞癌患者的有效率，無進展生存期與總生存期與多態性相關的多變量分析

VEGFR3是VEGF的一個跨膜的酪氨酸激酶受體，主要與淋巴管生成相關，盡管該受體的初始表達被局限于成人的淋巴管，但是研究已經確認VEGFR3不僅在腫瘤血管表達，而且認為其還是其他促血管生成因子的重要調節物。臨床前模型已經報道，VEGFR3與腫瘤的淋巴和遠處轉移的進展的相關性高于VEGFR2，進一步說明舒尼替尼可以影響血漿可溶性VEGFR3的濃度，這樣的變化與舒尼替尼治療腎癌的藥物療效有關。本研究發現，2個VEGFR3的錯義SNPs rs307826（T494A）和rs307821（R1324L），與腫瘤患者PFS的相關性（見表3）相反，van和他的同仁們的研究并沒有顯示出rs307826與舒尼替尼的治療后PFS的顯著相關性。然而這個帶分歧的結論可能與入選研究的患者差異有關。特別是在van的研究中41％患者在接受舒尼替尼之前是使用過其他治療藥物的，而本研究的患者則不允許使用其他治療，因為rs307862和rs307821是中等連鎖不平衡（webappendix p5），因此判斷哪個是原因性SNP有困難，或者2者對舒尼替尼的治療反應都有作用。rs307826影響中度保守的核苷酸，rs307821影響相對弱保守的核苷酸，因為T494A位于VEGFR3免疫球蛋白的同源結構域的5片段（即D5），而R13241L位于蛋白的C-M末端區域。在2個case中生物信息學工具（例如 SIFT 和Align GVGD）預測氨基酸的變化可影響蛋白的功能。然而D5~D5之間的作用可以解釋VEGFR3 的二聚體的穩定性和活化。因為本研究顯示了這個SNP與舒尼替尼的治療反應和PFS之間的顯著相關性，因此認為rs307862 是原因性變異體，而rs307821不是，是否VEGFR3變異體能否影響患者的預后還未確定。但是它與藥物的總體反應的相關性表明它在藥物療效方面發揮的重要作用。

圖2 對比CYP3A5中rs776746位點的變異型來分析舒尼替尼治療因不良反應減量的時間的Kaplan-Meier曲線

表4 引起舒尼替尼減量和不良反應的基因因素

即使是在多個檢驗糾正后，因不良反應而減量的風險仍與CYP3A5*1顯著相關（見圖2和表4），它影響CYP3A5的酶的表達。CYP3A5與 CYP3A4分享底物特異性，CYP3A4是催化舒尼替尼代謝的關節酶，這樣CYP3A5*1可能導致舒尼替尼活躍而且作用時間長的代謝物SU12662的產生增加，SU12662可引起不良反應。如果確定的話，CYP3A5*1等位基因的頻率主要的民族差異在非洲后裔和亞洲后裔中更常見，而歐洲人相對少。這就可以解釋在亞洲人中舒尼替尼毒性發生率更高的原因，很顯然，von和其同仁們報道CYP3A5*1與PFS改善的相關性，對于CYP3A5*1攜帶者的舒尼替尼藥物動力學情況有待未來進一步研究闡明。特別的毒性（見表4）與高血壓最顯著相關的SNPs是 VEGFR2、VEGF-A、ABCB1。rini和他的同仁們確立了高血壓是舒尼替尼治療反應的重要預測因素，這樣推斷，這三個SNPs可以作為舒尼替尼療效的代表性標志物。與此一致，它作為高血壓的保護者，帶有ABCB1 rs1128503的變異T等位基因的患者與不帶此基因患者相比OS和PFS差（見表3）。然而由于2個研究中血壓的檢測方法不一樣，所以無法進行直接的對比。

查詢資料，僅有一個評估了舒尼替尼不良反應的藥理學研究以及一個評估治療作用的研究已經公開發表，盡管研究結果挺有意義，但因為研究是探索性的，多個檢驗未作矯正。與本研究不一樣的還有，這些研究中允許使用其他藥物治療。資料是回顧性收集整理的，在毒性-效果研究分析中還包括了腎癌患者之外的腫瘤患者。盡管有這些不同，一些相關性的報道還是具有相似性，（例如ABCB1 rs 1128503與 PFS（P=0.089），OS（P=0.055）下降有關。VEGFR2 rs1870377與 OS下降有關（P=0.092）。

本研究還存在一定的局限性，時間和劑量的調整沒有在核心的方案中確定，放射學評估的時間是根據每一研究中心自己確定，因為研究和結果的評估是按照當前的臨床實際進行的，這樣治療的療程無法標準化。heng 和他的同仁已經建立把血紅蛋白，糾正的鈣，性能狀態，診斷后時間，中性粒細胞，血小板作為使用抗血管生成藥物治療轉移性腎細胞腎癌的臨床結果預測因子，然而本研究在這個報告發表前已經開始，所以沒有基線中性粒細胞數書籍，這樣不能將此模型應用到我們研究的患者人群中。與舒尼替尼治療結果相關的SNPs 具有相對低的等位基因頻率（9％rs307821，8％rs307826，和6％ rs776746），降低了研究效力。最后結果本研究不包括前瞻性和外部的驗證，本研究的對象主要是白種人，這些多態性與舒尼替尼藥物治療的相關性需要在其他人種中進行研究和評估。為保證我們資料的同質性，僅有透明細胞腎癌患者入選，并排除使用其他治療藥物的患者，并且研究資料由外部監察員進行審核，

所有這些因素可能是本研究結果具強有說服力的保證，而且在多重檢驗矯正正偏差后，經統計學分析仍有顯著相關性。

本研究結果保證了藥代動力學研究更好的理解舒尼替尼治療后減量的分子生物學機制，有待進一步在獨立的系列研究中得到驗證，如果本研究上述結論能夠確定，未來這些遺傳學變異能夠為個體化腎癌治療提供有力的基礎。

4 系統性綜述

使用關鍵詞腎癌、舒尼替尼，多態性查找了截止2007年8月的pubmed和美國臨床腫瘤學數據庫確定沒有有關SNP與舒尼替尼治療療效的相關研究。

搜索pubmed確定了舒尼替尼藥代和藥動相關的基因，在回顧了SNPs數據庫中列出的已知多態性后，選擇了感興趣的基因的變異體。在患者招募期間，一個前瞻性研究有關多態性與藥物毒性相關性研究公開發表，1年以后有關PFS和OS的另一研究發表。基于這些報道，我們沒有更改之前的起初的SNP的選擇，但是我們參考了來自帊唑帕尼藥理學研究的初步資料，加入了 IL8 的多態性分析。

5 結論

本研究是第一個前瞻性評估單核苷酸多態性作為之前未接受治療的進展性腎細胞癌患者接受舒尼替尼為一線藥物的藥物療效、不良反應的預測因素，我們注意到VEGFR3的2個錯義多態性與PFS 顯著相關，并且CYP3A5*1等位基因與因舒尼替尼不良反應而減量的風險增加有相關，如果我們的發現能夠在獨立的系列研究中得到確認，這些多態性可有助于診斷鑒別這一腎癌亞型，并有益于選擇合適的治療方法。