宮頸癌中Survivin mRNA的表達及其臨床價值

湖北省武漢市第五醫院婦科

黃 玲 鄧梅先 宋 芳 劉敏娟 沈漢斌

惡性腫瘤的發生、發展是一個涉及到多基因的分子水平變化的多階段過程。近年分子生物研究表明，宮頸癌為多基因、遺傳、環境等致癌因素等誘導下綜合作用的結果，細胞凋亡在宮頸癌發生發展過程中起重要作用。survivin也稱生存素或生存蛋白，是凋亡抑制蛋白家族（IAP）的成員，在體外能夠直接抑制細胞凋亡下游效應器caspase的活性，具有強大的抗凋亡作用[1,2]。在此我們運用RTPCR方法對22例宮頸癌及其癌旁組織，以在mRNA水平評價survivin基因表達及其變化，了解其與新輔助化療療效之間的相關性，為新輔助化療尋找有效的預測因子。

1 資料與方法

1.1 病例及分組 宮頸癌組：選取2003～2009年間我院收療的宮頸癌組織22例，病理診斷均為宮頸癌。年齡29～59歲，平均年齡37.2歲。22例宮頸癌中腺癌4例，鱗癌18例。臨床病理分期為：Ⅰb期12例，Ⅱa期8例，Ⅱb期2例。癌旁組織組：標本取自上述22例病例距腫瘤2cm以遠的組織，經病理檢查均無癌。所有樣品取出后均凍存于-70℃待檢。

1.2 化療方案 所有患者接受PVB或PF方案的新輔助化療方案，10天為1個周期，共進行2個療程。在接受新輔助化療前接受臨床觸診估測及超聲檢測，每周期化療結束后重新測量腫瘤大小，全部化療結束后再檢測。腫瘤對化療的臨床評價根據WHO標準[3]，腫瘤對化療反應的組織學評價根據Ogston的分級方法[4]。

1.3 Survivin mRNA檢測 Trizol試劑購自Gibco公司。MMLV逆轉錄酶、RNA抑制物為Promega公司產品。DNA聚合酶購自日本Takara公司。兔抗人survivin多克隆抗體為Santa Cruz公司產品。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自北京中山生物工程公司。

取凍存組織50～100mg，加入1ml Trizol（Gibco公司）充分勻漿，按照二步法提取組織中的總RNA。取少量樣本測定RNA的濃度（計算濃度公式為：樣品的A260值×40×稀釋倍數，單位是μg/ml）和純度（樣品的A260/A280比值），紫外分光光度儀A260nm/A280nm讀數在1.8～2.0之間方繼續試驗。

應用20μl反應體系，每管中加入模板RNA1μg，oligo（dT）50pmol，5×PCR反應緩沖液4μl，dNTP混合物（10mmol/L）2μl，R Nase Inhibitor20U，MMLV反轉錄酶10U，加DEPC處理的水至20μl?；旌虾?500r/min離心2min，室溫放置10min后轉入42℃反應1h，99℃5min滅活反轉錄酶活性，冰水中冷卻2min，完成cDNA合成。人類survivin的PCR引物為5′-CTCAAGGACCACCGCATCTC-3′和5′-CCTCAATCCATGGCAGCCAG-3′，合成產物為392bp，合成產物247 bpβ-actin作為內參照。所有引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件分析。根據數據性質采用χ2檢驗。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 Ssurvivin mRNA表達 宮頸癌組標本中Survivin mRNA陽性率為77.3％（17/22），而癌旁組織組表達陰性。而β-actin在宮頸癌組織和對照的癌旁組織中的表達強度基本一致（見圖1）。

2.2 新輔助化療的效果 22例患者經過新輔助化療后，有1例獲得臨床完全緩解（cCR），占4.5％（1/22）；12例獲得臨床部分緩解（PR），占54.5％（12/22）；9例獲得臨床穩定（SD），占40.9％（9/22），無1例發生疾病進展（PD）。

2.3 Ssurvivin mRNA在宮頸癌患者各特征性因素中的表達 Survivin mRNA表達陽性在37.2歲以下為10/12（83.3％），37.2歲以上為7/10（70.0％）；病理分型：腺癌為4/4（100.0％），鱗癌為13/18（72.2％）；腫瘤分期：Ⅰb為9/12（75.0％），Ⅱa期為6/8（75.0％），Ⅱb期為2/2（100.0％）；Survivin mRNA的表達與患者的年齡、病理分型、分期均無關（P＞0.05）；Survivin mRNA表達陽性在新輔助化療后完全緩解（cCR）的患者中為0/1（0.0％）、獲得臨床部分緩解（PR）的患者為8/12（66.7％）和獲得臨床穩定（SD）的患者為9/9（100.0％），差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是發病率和病死率僅次于乳腺癌的最常見的女性惡性腫瘤。近40年來隨著宮頸癌篩查的普及開展，其發病率及病死率已明顯下降，但有年輕化趨勢，關于這種趨勢的原因和特點已引起國內外的廣泛關注[5]。宮頸癌細胞的侵襲和轉移是一個復雜過程，涉及到血管、淋巴管新生、細胞外基質降解和細胞凋亡調控等很多因素。

注：L1為宮頸癌擴增電泳結果（392bp）；L2為宮頸癌旁組織電泳結果

近年研究發現，凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）家族在細胞凋亡的基因調控中發揮重要作用[6]，凋亡不僅在正常生理調節中起關鍵作用，在惡性病變過程中也起著重要作用。細胞凋亡過程受凋亡抑制基因與凋亡活化基因的共同調節[7,8]。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是IAP家族中最小的成員，它由定位在人染色體17q25位點的單拷貝基因編碼，是含有142個氨基酸、相對分子質量為16 500的蛋白，具有抑制凋亡和調節細胞分裂的作用[7]。survivin其結構獨特，僅含有一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列（BIR）分子，作用于各種凋亡通路末端效應分子，是迄今發現最強的凋亡抑制因子之一。實驗研究證實[9]，survivin能抑制Fas、caspase、bax及某些化療藥物誘導的細胞凋亡。survivin的組織分布特征具有明顯的細胞選擇性，在正常成人組織中幾乎未檢測到survivin基因的表達[10]。而在大多數腫瘤組織內有survivin的表達，這種重新表達的機制目前尚不明確[11]。survivin具有周期依賴性表達及抗凋亡作用。

Kim等[12]采用免疫組化方法檢測了4l例宮頸內皮瘤和宮頸鱗狀細胞癌，結果顯示survivin在低度鱗狀上皮內瘤樣病變、高度鱗狀上皮內瘤樣病變及SCC中的陽性表達率分別是66.7％、87.5％和100％，差異有統計學意義（P＜0.01），表明sruvivi陽性表達與宮頸腫瘤的進展密切相關。本研究對宮頸癌組織Survivin mRNA表達測定發現，宮頸癌細胞高表達Survivin mRNA，本組陽性率為77.3％。腫瘤細胞Survivin mRNA表達水平較正常宮頸組織明顯增高，表明其與宮頸癌發生發展密切相關，可能是參與抑制惡性瘤細胞的凋亡過程中的關鍵因素。Survivin mRNA表達與臨床特征相關性的分析顯示，腫瘤內Survivin mRNA的表達與宿主年齡、病理分型、分期均無關。

研究顯示，survivin與宮頸癌的形成和發展有著密切的關系[13]，其過度表達可克服凋亡的關卡，通過有絲分裂促進轉化細胞的異常增殖；survivin的過表達可能與化療藥物的耐藥性相關[14]。本研究結果顯示，宮頸癌化療Survivin mRNA的表達水平與新輔助化療療效存在相關性，即新輔助化療后獲得臨床穩定（SD）的患者、獲得臨床部分緩解（PR）和完全緩解（cCR）的患者相比，后者的化療療效好于前者。本研究結果顯示了Survivin mRNA的表達陽性的化療療效效果差也可能與順鉑耐藥相關。

通過對宮頸鱗癌組織及癌旁組織中Survivin mRNA表達的研究，提示宮頸癌的發生、發展與細胞凋亡調節異常及細胞增殖活性增加有關。Survivin mRNA的異常表達與宮頸癌的發生、發展相關，可以作為宮頸癌新輔助化療療效的手段之一。Survivin mRNA在宮頸癌組織中的異常表達，導致細胞凋亡減少，對宮頸癌的發生起到重要作用，可為臨床篩查宮頸癌及判斷預后提供新的依據和診斷指標。

[1] Li F,Ambrosini G,Chu EY,et al.Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by surviving[J].Nature,1998,396（6711）：580 -584.

[2] Zhao J,Tenev T,Martins LM,et al.The ubiquitin proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle dependent manner[J].J Cell Sci,2000,113（23）：4363-4371.

[3] Miller AB,Hoogstraten B,Straquet M,et al.Reporting results of cancer treatment[J].Cancer,1981,47（1）：207-214.

[4] Ogston KN,Miller I,Payne S,et a1.A new histological grading system to assess response of breast cancers to primary chemotherapy：prognostic significance and surviva1[J].Breast,2003,12（5）：320-327.

[5] Bulk S,Visser O,Rozendaal L,et al Cervical cancer in the Netherlands 1989-1998：decrease of squamous cell carcinoma in older women,increase of adenocarcinoma in younger women[J].Cancer, 2005,113（6）：1005-1009.

[6] Nachmias B,Ashhab Y,Ben-Yehuda D.The inhibitor of apoptosis protein family（IAPs）：an emerging therapeutic target in cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14（4）：231-243.

[7] Mita AC,Mita MM,Nawrocki ST,et al.Survivin：key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics[J].Clin Cancer Res,2008,14（16）：5000-5005.

[8] Pennati M,Folini M,Zaffaroni N.Targeting survivin in cancer therapy：fulfilled promises and open questions[J].Carcinogenesis,2007,28（6）：1133-1139.

[9] Lee JP,Chang KH,Hart JH,et a1.survivin,a nocel anti-apoptosis inhibitor,expression in uterine cervical cancer and relationship with prognostic factors[J].Int J Gynecol Cancer,2005,15（1）：113-119.

[10] Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3（8）：917 -921.

[11] Adida C,Crotty PL,Mograth J,et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene surviving in human and mouse differentiation[J].Am J Pathol,1998,152（1）：43-49.

[12] Kim HS,Shiraki K,Park SH.Expression of survivin in CIN and invasive squamou cell carcinoma of uterine cervix[J].AnticancerRes,2002,22（2A）：805-808.

[13] Kim HS,Shiraki K,Rark SH.Expression of survivin in CIN and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix[J].Anticancer Res,2002,22（2A）：805-808.

[14] Xiong HH,YU SY,Zhang L,et a1.Changes of survivin mRNA and protein expression during paclitaxel treatment in breast cancer cells[J].JHuazhongUniversity of science and Technology,2007,27：65-67.