FLAG標記的Kir2.3通道的構建、表達及其對Kir2.3通道功能的影響

趙志英，朱宏謙，張 哲，劉 麗，張國紅

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，教育部血管與神經生物學重點實驗室，河北省新藥藥理毒理研究重點實驗室，河北石家莊050017；2.河北省公安廳國家安全保衛(wèi)總隊，河北石家莊050000 3.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，河北省老年醫(yī)學重點實驗室，河北石家莊050051）

·論 著·

FLAG標記的Kir2.3通道的構建、表達及其對Kir2.3通道功能的影響

趙志英1，朱宏謙2，張 哲3，劉 麗1，張國紅1

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，教育部血管與神經生物學重點實驗室，河北省新藥藥理毒理研究重點實驗室，河北石家莊050017；2.河北省公安廳國家安全保衛(wèi)總隊，河北石家莊050000 3.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，河北省老年醫(yī)學重點實驗室，河北石家莊050051）

目的構建FLAG標記的內向整流鉀通道（inwardly rectifying K channel，Kir）2.3通道蛋白，為進一步研究通道的生理功能和調節(jié)機制奠定基礎。方法運用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，將FLAG標記短肽DNA堿基序列插入到Kir2.3通道氨基末端，構建重組質粒DNA，FLAG-Kir2.3-pGEMHE；采用菌落PCR方法挑取陽性克隆，表達于非洲爪蟾卵母細胞，驗證加入標記后是否影響Kir2.3通道蛋白的功能；進行免疫細胞化學實驗，檢測FLAG標記短肽表達情況。結果經測序驗證，FLAG-Kir2.3-pGEMHE重組質粒DNA構建成功，沒有堿基突變。FLAG標記短肽沒有影響Kir2.3通道功能，FLAG-Kir2.3成功表達于非洲爪蟾卵母細胞，雙電極電壓鉗可以記錄到電流。免疫細胞化學實驗證實FLAG標記短肽表達。結論成功構建重組質粒DNA，FLAG標記短肽已與Kir2.3通道蛋白成功融合并有效表達。

鉀通道，內向整流；聚合酶鏈反應；免疫組織化學

內向整流鉀通道（inwardly rectifying K channel，Kir）是在各種組織中廣泛分布的一種鉀離子通道，Kir2.0鉀通道的特征是具有很強的內向整流特性，這種通道的整流作用有利于維持細胞的靜息電位并參與復極化過程［1］。Kir2.3是Kir2.0家族中的重要一員，已知可以被細胞內或細胞外的信號分子如Mg2+、多胺、H+、PKC等調控［2］。研究Kir2.3的調控機制對研究內向整流鉀通道家族的調控機制有重要意義。FLAG是通用抗原表位標記物之一，已廣泛應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及蛋白相互作用等領域。本實驗將FLAG標簽連接于Kir2.3氨基末端［3］，構建重組質粒DNA，FLAG-Kir2.3-pGEMHE，為進一步研究Kir2.3通道蛋白的生理功能和調節(jié)機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料：Kir2.3 cDNA克隆于質粒pGEMHE中，pGEMHE載體質粒DNA由美國紐約大學西奈山醫(yī)學院（Mount Sinai Medical School）生理學系Diomedes Logothetis教授惠贈。Anti-FLAG M5 monoclonalantibody購自美國Sigma公司，PyrobestTM DNA Polymerase購自日本Takara公司。實驗用非洲爪蟾（Xenopus laevis），購于中科院上海神經科學研究所。

1.2 方法

1.2.1 構建重組質粒DNA：FLAG-Kir2.3-pGEMHE設計引物，將FLAG標記短肽（DYKDDDDK）插入到Kir2.3-pGEMHE的DNA堿基序列氨基末端，同時加入酶切位點EcoRI及保護性堿基，設計引物如下，上游引物（50 bp）5' AGGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGCACGGACACAGC 3'，下游引物（24 bp）5' ACCAGATCAAGCTTGCTCTAGAGA 3'。采用高保真DNA聚合酶進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應，PCR回收產物及載體pGEMHE質粒DNA同時進行EcoRI酶切，載體去磷酸化，連接產物轉化后，采用菌落PCR篩選陽性克隆，菌落PCR引物如下，上游引物（24bp）5' TCTTCTCCGCGGCCTTCCTTGTCT 3'，下游引物（24 bp）5'CGGGCAGCACGGTGATCTTACTCT 3'。用BamHI鑒別插入片段方向是否正確［4-5］。經測序選取無堿基突變的克隆。

1.2.2 重組FLAG-Kir2.3通道蛋白表達于非洲爪蟾卵母細胞：將重組質粒DNA和Kir2.3-pGEMHE質粒DNA同時用限制性核酸內切酶NheI線性化，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit試劑盒進行體外轉錄得到它們的cRNA。分離爪蟾卵母細胞，膠原酶消化為單個細胞后用ND96清洗細胞。將FLAG-Kir2.3和Kir2.3 cRNA分別注入爪蟾卵母細胞，18℃培養(yǎng)。雙電極電壓鉗（two-microelectrode voltage clamp，TEVC）記錄電流是否表達。灌流液ND96（mmol/L），NaCl 96，KCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用NaOH調節(jié)pH為7.4；ND96K（mmol/L），KCl 96，NaCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用KOH調節(jié)pH為7.4。

1.2.3 免疫細胞化學實驗：將表達帶有FLAG標記短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細胞與表達未帶有FLAG標記短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細胞同時進行4%多聚甲醛固定過夜，PBS清洗3次過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成切片，相鄰切片做HE染色和免疫細胞化學實驗［6］。免疫細胞化學實驗將切片進行抗原修復，封閉血清封閉，Anti-FLAG M5單克隆抗體4℃過夜，PBS清洗3次，加入辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠IgG，37℃45min，PBS清洗3次，DAB顯色，光鏡下觀察是否有陽性表達及其表達部位。

2 結 果

2.1 構建重組質粒DNA：Kir2.3通道蛋白氨基末端（N末端）在細胞內起始，2次跨膜折疊后羧基末端（C末端）在細胞內終止，N末端較短，C末端較長，且C末端對通道在細胞膜的定位與信號傳導有重要作用。所以我們選擇在Kir2.3通道N末端添加FLAG序列。以Kir2.3-pGEMHE質粒DNA為模板DNA，經過PCR反應，得到的產物片段長度與Kir2.3的堿基數相似，約為2 000bp（圖1）。PCR擴增產物經測序結果證實為目的產物，非假陽性擴增。PCR回收產物及載體pGEMHE質粒DNA分別用EcoRI酶切并純化。因本次連接反應為同源黏末端連接，為了最大程度減少載體自身連接反應，減少高背景假陽性克隆，載體必須進行去磷酸化。進行菌落PCR篩選陽性克隆。在900 bp處有條帶為陽性克隆，無條帶為陰性克隆（圖2），1、3、4、5、6、11、12、13為陽性克隆。挑取其所對應的菌落，進行擴菌增菌，提取質粒DNA，用限制性核酸內切酶BamHI鑒別插入片段方向是否正確。因為酶切位點BamHI在載體pGEMHE和插入片段Kir2.3的DNA序列中都存在，酶切位點BamHI在pGEMHE的DNA序列第83位，在酶切位點EcoRI上方6個堿基，Kir2.3的DNA堿基數為1 913，酶切位點BamHI在其DNA序列第1 677位，因此，若為正向連接，BamHI酶切可得2個片段3 341bp和1 594bp，若為反向連接，BamHI酶切可得2個片段4 616bp和319bp（圖3），可見3、6、12為正向連接。將連接正確的克隆進行測序，篩選無堿基突變的克隆，至此重組質粒DNA構建成功。

2.2 PMA對Kir2.3和FLAG-Kir2.3通道電流的作用：將由重組質粒DNA和Kir2.3-pGEMHE質粒DNA轉錄而來的cRNA分別注入卵母細胞，記錄電流。PMA為PKC激活劑，可以明顯抑制Kir2.3電流。首先在高鉀細胞外液（ND96K）中，-80mV～+80mV的斜坡電壓記錄電流，圖4A所示為Kir2.3電流及給PMA后電流-電壓曲線變化，圖4B所示為重組通道電流及給PMA后的相應電流-電壓曲線變化，最后用ND96外液沖洗以建立零電流基線（ND96外液中，Kir2.3在-80mV電流很小）。圖4C、D為以上2種通道在給PMA前后電流-時間變化結果。虛線為零電流，虛線下曲線為鉗制電壓為-80mV電流，虛線上曲線為鉗制電壓為+80mV電流，結果顯示0.5μM PMA能夠明顯抑制2種通道電流，抑制率分別為（46.3±5.2）%、（44.8± 6.1）%，PMA對2種通道的抑制率經比較差異無統計學意義（P＞0.05）。這說明FLAG標記短肽未影響Kir2.3通道蛋白表達及其電流特性，為以后研究Kir2.3通道蛋白的特性和調節(jié)機制奠定了基礎。

2.3 免疫細胞化學實驗：使用Anti-FLAG M5 monoclonal antibody，可以特異性與FLAG肽段結合，再加入辣根過氧化物酶耦聯的二抗，經免疫細胞化學染色，可見表達FLAG-Kir2.3重組通道蛋白的爪蟾卵母細胞細胞膜有棕黃色沉淀顆粒聚集，表達Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母細胞細胞膜卻未見有特異性沉淀顆粒聚集（圖5A，B）。由于Kir2.3通道蛋白是膜蛋白，所以棕黃色沉淀顆粒聚集于細胞膜，證實了FLAG標記短肽確實已與Kir2.3通道蛋白成功融合并穩(wěn)定表達。

3 討 論

DNA重組技術是一項復雜龐大的系統工程，簡單地說，它包括4個大的步驟，目的基因的獲得；目的基因與載體的體外重組；重組后的DNA分子導入受體細胞；轉化細胞的篩選和外源基因的表達。抗原表位標記是一項很有用的技術，可以鑒定未經純化的感興趣的蛋白，能夠使用經過很好的鑒定和高度特異性的抗體來研究感興趣的蛋白，不用經長時間費力的過程來生產和鑒定抗體。大多數蛋白可以在一端或其他區(qū)域接受標記物，不嚴重喪失功能。但應盡量把表位標記物加在靶蛋白的氨基或羧基末端，這樣最可能接近抗體，而最不可能干擾靶蛋白的功能。FLAG是常用的抗原表位標記物，可以通過蛋白酶水解切割從靶蛋白中除去，當把FLAG序列加在靶蛋白的氨基末端，需要在其堿基序列前加起始密碼子ATG［7］。FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利于研究人員對融合蛋白進行下游研究，現FLAG標簽已廣泛應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等領域［8］。雖然現在商品化帶有FLAG標簽的真核表達載體很多，但本實驗在非洲爪蟾卵母細胞進行表達，可以選擇的載體只有pGEMHE，不能用現成的表達載體，增加了實驗難度。

進行抗原表位標記的方法很多，常用為PCR，如在PCR引物序列中加入抗原表位堿基序列以及重疊延伸PCR等。本實驗采用方法為在PCR引物中加入FLAG堿基序列，PCR循環(huán)數應盡量少，以減少平臺效應和非特異性擴增產物干擾，減少堿基突變發(fā)生率。為便于克隆，還要在引物兩端加上酶切位點和保護性堿基。載體與插入片段以相同的限制性核酸內切酶進行切割，形成同源黏末端，這是最方便的克隆途徑。本實驗由于載體質粒pGEMHE中酶切位點很少，可以選擇的酶切位點只有EcoRI，故本次試驗只能用單酶切進行連接，無疑增加了實驗難度。由于本實驗上下游引物所加酶切位點相同，用同一種限制酶剪切形成的載體片段，其兩個末端的序列是互補的，在連接反應中能夠自身連接，恢復成環(huán)，重新形成原來的載體分子，因此在連接前，必須將線性載體分子進行5'末端脫磷酸化處理，使載體分子無法自身連接成環(huán)，而帶有5'端磷酸基團的外源DNA片段在DNA連接酶作用下可有效的與去磷酸化的質粒DNA連接，形成含2個缺口的開環(huán)分子，開環(huán)分子的轉化效率明顯高于去磷酸化的線狀DNA。因此，脫磷酸化處理后進行連接反應時，加大連接酶的用量方能達到有效連接，減少克隆過程中“空心”克隆產生的數目。由于有高背景假陽性克隆存在，為陽性克隆篩選增加了很多麻煩，采用菌落PCR擴增篩選法，既準確又簡單、經濟有效［4］。由于此步驟只是篩選故不必用高保真DNA聚合酶。在連接反應中適當增加插入片段與載體的摩爾比也是行之有效的一種方法。送樣品測序時要多送幾個樣品，尤其是本實驗，插入片段為2 000bp，突變幾率大，對保真性要求高。重組DNA成功表達于非洲爪蟾卵母細胞，雙電極電壓鉗記錄電流有表達，PMA對FLAG標記的重組通道的抑制程度與沒有帶有FLAG標記的Kir2.3通道相同［9］。免疫細胞化學實驗證實FLAG抗原表位標記短肽確實已與Kir2.3通道蛋白成功融合并有表達［10］。通過在PCR引物序列中加入FLAG序列所對應的DNA堿基序列，成功構建了FLAG-Kir2.3-pGEMHE重組通道，FLAG標記穩(wěn)定表達且未影響Kir2.3通道蛋白功能，為進一步研究Kir2.3通道的生理功能和調節(jié)機制奠定了基礎。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

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《河北醫(yī)科大學學報》編輯部

CONSTRUCTION OF FLAG TAGGED KIR2.3 CHANNEL，ITS EXPRESSION AND FUNCTIONAL STUDY

ZHAO Zhiying1，ZHU Hongqian2，ZHANG Zhe3，LIU Li1，ZHANG Guohong1
（1.Department of Pharmacology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University；The Key Laboratory of Neural and Vascular Biology，Ministry of Education；The Key Laboratory of New Drug Pharmacology and Toxicology，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China；2.National Security Corps，Public Security Department of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；3.The Clinical Trial Center People's Hospital of Hebei Province；Hebei Provincial Key Laboratory of Geriatrics，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveFlag tag will be inserted into the upstream of Kir2.3-pGEMHE DNA sequence，which will lay a basis for future research.MethodsThe DNA base sequence corresponding to the amino acid sequence of Flag peptide was inserted into the N-terminus of Kir2.3 by polymerase chain reaction（PCR）.The recombinant plasmid DNA FLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed.The correct clones were chosen by the method of colony PCR and sent for sequencing.Flag-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes.The function of FLAG tagged Kir2.3 channel was studied.Immunocytochemistry method was applied to confirm that the Flag-Kir2.3 was expressed on the membrane of the Xenopus oocytes.ResultsAfter examination by sequencing，the Flag tag was found to be inserted into the N-terminus of Kir2.3-pGEMHE.FLAG-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes successfully. Channel currents were recorded by two-microelectrode voltage clamp（TEVC）.Immunocytochemistry experiments showed that the Flag tag was fused with Kir2.3 channel protein successfully.ConclusionFLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed by means of PCR successfully.Moreover，the Flag tag did not affect Kir2.3 channel function.These results laid a basis for future research.

potassiumchannels，inwardlyrectifying；polymerasechainreaction；immunohistochemistry

R966

A

1007-3205（2012）12-1365-04

2012-11-12；

2012-12-03

國家自然科學基金資助項目（30900267）；教育部高等學校博士點新教師基金資助項目（20091323120006）；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學重點指導項目（20090321）

趙志英（1975-），女，河北保定人，河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院副教授，醫(yī)學博士，從事離子通道藥理學研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.001