電針預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠pSTAT3蛋白表達的影響*

王振宇，王希文，孫忠人，劉睿姝

(黑龍江中醫藥大學針灸臨床神經生物學實驗室，黑龍江哈爾濱150040)

腦缺血再灌注損傷后缺血周邊半暗帶區的神經元死亡與細胞凋亡密切相關，JAK/STAT信號轉導通路對腦卒中細胞凋亡的調控起著重要作用［1～2］。目前研究已證實腦缺血預處理可以抑制腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡，本實驗室既往研究表明針灸預處理具有顯著的抗腦缺血后細胞凋亡、減輕神經功能缺損的作用［3～6］。本課題以局灶性腦缺血再灌注大鼠模型為觀察對象，研究電針預處理對JAK/STAT家族中的重要成員STAT3蛋白表達的影響，以期從一個側面再次證明針灸預處理是抑制腦缺血后細胞凋亡的有效手段。

1 材料與方法

1．1 實驗動物和試劑

健康Wistar大鼠36只，雄性，體質量180～200 g，1．5月齡。購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證編號:P00102004。pSTAT3單克隆抗體均為Santa Cruz，CA公司產品;Western blotting試劑盒為美國Upstate Biotechnology，Inc公司產品;TTC試劑盒為上海國藥集團產品。

1．2 造模方法

采用改良的Longa法制備局灶性腦缺血再灌注損傷(MCAO)大鼠模型:10%的水合氯醛注射液(300 mg/kg)腹腔麻醉實驗動物，左旁正中縱行切開頸部皮膚約25 mm，仰臥位暴露并且鈍性地游離左側頸總動脈，結扎同側頸總動脈近心端和頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內動脈;距離頸總動脈的分叉處約2～3 mm處刺一小口入栓塞線，松開頸內動脈動脈夾，栓線經頸總動脈進入頸內動脈，達到大腦前動脈起始部位，遇到阻力后停止，長度約為20～22 mm，然后用縫合線系住栓塞線，最后確認無出血后再縫合皮膚，缺血90 min后將栓塞線拔出約10 mm形成缺血再灌注。假手術組大鼠不插入栓塞線，其他步驟同手術組。

1．3 實驗動物分組

將大鼠按隨機數字表法分為3組:假手術組(sham)、模型組(MCAO)、電針預處理組(EA)，每組12只動物，分別于手術后24 h斷頭取腦，每組6只用于TTC染色，6只Western blotting。

1．4 電針預處理方法

電針預處理于造模前7天(實驗第1天)，每日早8∶00開始給予電針治療，每日1次，至實驗造模(實驗第7天)。將大鼠置于固定器內，待大鼠安靜20 min后，將0．25 mm×13 mm毫針水平刺入大鼠頭皮左、右“神聰穴”與左、右“懸厘穴”約5 mm，采用KWD－808Ⅱ型脈沖電針儀，分別連接兩側“神聰穴與懸厘穴”，規律脈沖電波，強度6 V，頻率分別2/100 Hz(2 Hz和100 Hz交替)持續30 min。

1．5 腦梗死體積的觀察

大鼠在缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取出腦組織后將其放置在－20℃冰箱中快速冷凍15 min，均勻的由前向后于冠狀位切成厚度2 mm的腦組織6片，把切好的腦片立即避光放置在2%TTC磷酸緩沖溶液當中，37℃下恒溫孵育0．5～1 h，待腦片完全地顯示顏色后放置在4%多聚甲醛溶液中固定。血供正常組織染色呈紅色，缺血組織顏色無變化，呈白色。病理圖象分析系統測量腦梗死體積。

1．6 Western blotting

Western blotting檢測按照常規方法進行。大鼠在缺血再灌注24 h后，10%的水合氯醛注射液(300 mg/kg)腹腔麻醉實驗動物，立即斷頭取腦，于冰上分離缺血側腦組織的頂葉皮層，立即用冰生理鹽水沖洗，然后放置在液氮罐中低溫下保存。從液氮罐中取出腦組織，放置在組織勻漿器中，按照1∶5(w/v)加入細胞裂解液，立即放置在冰上勻漿。等待裂解30 min后迅速用移液器將裂解液移到1．5 ml的離心管當中，采用12 000 r/min 4℃下離心操作10 min，取離心的上清液置于－80℃保存。用考馬斯亮藍測定法檢測蛋白總量。加樣量為每孔20μg蛋白。于所制備的樣本中加入上樣緩沖液，迅速混勻后煮5 min，10 000 r/min下離心操作10 min，在SDS－PAGE電泳上等量上樣，在電泳操作完畢之后，迅速把蛋白轉移到PVDF膜上，然后采用PBS液進行封閉，再加入P－STAT3鼠單多克隆抗體(1∶1 200)及抗 β －actin(1∶2 000)抗體，將第一抗體稀釋放置于含3%脫脂奶粉的PBS緩沖液中，4℃下反應過夜后將膜取出，然后用PBS緩沖液洗滌3次，加入山羊抗兔/兔抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)進行孵育，最后采用化學發光法，X－光片下記錄檢測結果。

1．7 統計學處理

2 實驗結果

2．1 電針預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積的影響

局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的左側大腦中動脈梗死區域主要位于缺血側的額頂背外側皮層。電針預處理治療后腦梗死體積及腦組織腫脹程度與模型組比較均顯著性降低(P＜0．05)，局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的梗死體積縮小部位主要存在于梗死灶的周邊，見圖1。

2．2 電針預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織pSTAT3蛋白表達的影響

假手術組不存在pSTAT3蛋白的表達，局灶性腦缺血再灌注損傷24 h后pSTAT3蛋白表達顯著性增加，電針預處理能部分抑制pSTAT3蛋白表達，與模型組相比有顯著性差異(P＜0．05)，見圖2。

3 討論

在局灶性腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的發生為高度精密調節過程，涉及多條信號轉導途徑，JAK/STAT信號轉導通路對腦卒中細胞凋亡的調控起著重要作用。STAT3是JAK/STAT家族中的重要成員，過量活化的STAT3對神經細胞凋亡具有促進作用，它能降低腦缺血再灌注損傷中重要的抗凋亡基因Bcl－2等的表達［7～8］。

圖1 A．缺血再灌注24 h后大鼠腦組織TTC染色;B．電針預處理治療后腦梗死體積與MCAO組比較顯著性降低

圖2 Western Blot結果顯示電針預處理能明顯抑制pSTAT3蛋白表達

針灸預防中風(腦卒中)古來有之，唐代孫思邈的《備急千金要方》中有“惟風宜防爾，針耳前動脈及風府神良”或“依腧穴灸之”的針灸預防中風的具體記載。既往本實驗室研究表明［3～6］，針灸預處理能夠減少腦缺血后海馬CA1區神經元凋亡，上調海馬CA1區Bcl－2、c－fos的基因和蛋白表達。本研究揭示電針預處理能顯著下調局灶性腦缺血再灌注腦組織pSTAT3蛋白含量，明顯降低腦梗死的體積，對腦缺血再灌注損傷后神經細胞的保護有重要意義。

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