稀土水楊酸8－羥基喹啉三元配合物對(duì)黑曲霉活性的影響

劉美艷 肖圣雄劉 浩尹智偉

（1.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081；2.湖南省湘南稀貴金屬配合物及其應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 郴州 423000；3.湘南學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，湖南 郴州 423000）

黑曲霉是一類廣泛分布于土壤、空氣中的真菌，其某些種類可引起食物、谷物和果蔬及飼科與糧油的變質(zhì)，有可能產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素，還能使許多工業(yè)器材霉變［1］。由于黑曲霉的孢子具有較強(qiáng)的抗逆性，它們能在自然界中快速的散播和生存，而且在大量抑菌試驗(yàn)中很多抑菌劑對(duì)黑曲霉的抑菌效果并不理想［2，3］。因此，研制和開(kāi)發(fā)安全高效的黑曲霉殺菌劑是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

稀土配合物具有抗菌、消炎、抗腫瘤等作用，且多數(shù)稀土配合物的抗菌活性高于配體及稀土離子，主要是由于稀土與配體發(fā)生了協(xié)同作用，并且比許多有機(jī)合成物或過(guò)渡金屬配合物的毒性低［4］，為開(kāi)發(fā)稀土配合物抗菌劑提供了理論依據(jù)。鑒于黑曲霉的危害，本試驗(yàn)針對(duì)稀土、水楊酸（Hsal）與8－羥基喹啉（Hhq）的三元配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行研究，旨在為研發(fā)高效黑曲霉殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藥品試劑：稀土水楊酸8－羥基喹啉三元配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd），由本實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)［5］制備；

水楊酸：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

8－羥基喹啉（Hhq）：分析純，曹楊第二中學(xué)化工廠；

PrCl3·6H2O、GdCl3·6H2O：分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；

二甲基亞砜（DMSO）：分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；

瓊脂粉：生化試劑，天津市英博生化試劑有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）AF91004，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－50G 型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

超凈工作臺(tái)：SW－CJ－2F型，上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：AUY200型，日本島津公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX－150型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

振蕩培養(yǎng)箱：2102型，上海綠宇生物科技有限公司；

移液槍：20～200μL，大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司；

牛津杯：7.6mm×6mm×10mm，東臺(tái)市溱東鎮(zhèn)吉廣泰不銹鋼制品廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將黑曲霉菌種接種在PDA 斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)4～6d充分活化，再用無(wú)菌生理鹽水將新鮮菌株洗脫，制成孢子懸液A 10mL備用。

將黑曲霉預(yù)先在PDA 斜面培養(yǎng)基上活化兩代后再接種到液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)，使孢子懸液濃度達(dá)106CFU／mL左右，制成孢子懸液B備用。

1.2.2 待測(cè)藥品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取RECl3·6H2O（RE＝Pr、Gd），配體水楊酸、8－羥基喹啉及其配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd），然后分別用DMSO 配制為8mmol／L的溶液各10mL，待充分溶解后利用二倍稀釋法將各物質(zhì)溶液分別稀釋成4，2，1，0.5，0.25mmol／L的藥品溶液儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 藥品對(duì)黑曲霉的抑菌作用 采用杯碟法。試驗(yàn)前將牛津杯和移液槍槍頭置于60 ℃干燥箱中烘干后密封滅菌。將已滅菌的固體培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)倒制成平板。待其冷卻凝固后，在無(wú)菌操作條件下用移液槍吸取0.4mL 備用的孢子懸液A 至平板上，用無(wú)菌玻璃涂布棒涂布均勻，再用無(wú)菌鑷子夾取滅過(guò)菌的牛津杯置于平板上，每個(gè)平板放置3個(gè)，要求牛津杯與培養(yǎng)基之間無(wú)縫隙。待培養(yǎng)基表面的水分干燥以后，用移液槍向牛津杯中準(zhǔn)確加入30μL 待測(cè)溶液［6］。然后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平行試驗(yàn)5次，測(cè)得15組抑菌圈直徑D。

藥品抑菌能力測(cè)定：試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組1平板為加孢子懸液A 不加牛津杯，對(duì)照組2平板為牛津杯內(nèi)加入30μL DMSO。當(dāng)對(duì)照組1平板上布滿白色菌絲時(shí)，開(kāi)始測(cè)量試驗(yàn)組平板上的抑菌圈直徑，以藥品濃度在8 mmol／L時(shí)所產(chǎn)生的抑菌圈直徑作為標(biāo)準(zhǔn)，判斷藥品的抑菌能力。

參照衛(wèi)生部公布的《消毒技術(shù)規(guī)范2006》中對(duì)藥物抑菌活性強(qiáng)弱的規(guī)定判定結(jié)果：抑菌圈小于等于7.6mm 時(shí)無(wú)抑菌活性，抑菌圈大于7.6mm 小于10mm 時(shí)抑菌活性弱；抑菌圈大于等于10mm 小于20mm 時(shí)中等抑菌；抑菌圈大于等于20mm 強(qiáng)抑菌作用。即抑菌圈直徑越大抑菌活性越強(qiáng)［7，8］。

1.2.4 藥品最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 抑菌藥物在培養(yǎng)基中以牛津杯為中心向四周擴(kuò)散，在擴(kuò)散過(guò)程中濃度逐漸減小，直到抑菌藥物溶液濃度與對(duì)該種抑菌藥品的最高耐受濃度相等（即藥品溶液濃度小于藥品MIC），此時(shí)抑菌圈不再增大而形成具有恒定直徑的抑菌圈。本試驗(yàn)結(jié)合二倍稀釋法測(cè)定不同濃度下的藥品所形成的抑菌圈直徑，初步推測(cè)出其最小抑菌濃度［9，10］。

1.2.5 藥品最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

（1）配制不同濃度的含藥安瓿瓶：用少量的DMSO 將各藥品溶解后加入PDA 液體培養(yǎng)基配制成10mmol／L的各藥品母液100mL。按照表1中所示量取藥品母液加入到含不同量的液體培養(yǎng)基中，并充分混勻，配制成濃度為8.00～0.25mmol／L的配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）及配體8－羥基喹啉溶液各5mL。每濃度設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)組。

表1 不同濃度藥劑的配制Table 1 The preparation of drugs solution with different concentration

（2）加孢子懸液及培養(yǎng)：在含不同濃度的藥劑安瓿瓶中，各加入孢子懸液B 0.1mL，充分混勻。將上述安瓿瓶置于37 ℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h。

（3）轉(zhuǎn)接培養(yǎng)檢測(cè)藥品MBC：將培養(yǎng)后的各安瓿瓶培養(yǎng)物0.1mL接至新的PDA 平板培養(yǎng)基上，37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，以每皿菌落數(shù)小于5 的最低藥物濃度為MBC［11，12］。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)分析方法 用游標(biāo)卡尺從不同水平方向測(cè)量抑菌圈直徑3 次，求得其平均值作為抑菌圈直徑D，得15組數(shù)據(jù)D。

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用T 檢驗(yàn)法淘汰15組數(shù)據(jù)中95% 置信區(qū)間以外的數(shù)據(jù)，以置信區(qū)間內(nèi)保留值的平均值作為藥物所產(chǎn)生的抑菌圈直徑D。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥品對(duì)黑曲霉的抑制作用

試驗(yàn)對(duì)照組1在培養(yǎng)15h后長(zhǎng)滿白色菌絲，此時(shí)測(cè)得各藥品濃度在8mmol／L時(shí)所形成的抑菌圈直徑D 見(jiàn)表2。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判斷，由表2可知，配體8－羥基喹啉（Hhq）、配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）產(chǎn)生的抑菌圈直徑都大于20mm，具有強(qiáng)抑菌作用，且配合物的抑菌效果強(qiáng)于配體Hhq。RECl3·6H2O（RE ＝Pr、Gd）溶于DMSO 后電離出稀土（RE ＝Pr、Gd）離子和氯離子，結(jié)果表明兩種離子都不存在抑菌效果。當(dāng)無(wú)抑菌活性的稀土（RE ＝Pr、Gd）離子與配體形成配合物后抑菌效果明顯增強(qiáng)，說(shuō)明稀土離子與配體之間存在協(xié)同作用。

表2 藥品的抑菌圈直徑Table 2 Antibacterial circle diameter（abbreviation：ACD）of experimental drugs

2.2 藥品的最小抑菌濃度

培養(yǎng)15h后測(cè)得不同濃度藥品所產(chǎn)生的抑菌圈直徑D見(jiàn)表3。

由表3和圖1可知，在不同濃度下配合物的抑菌能力都明顯強(qiáng)于其配體。配合物Pr（sal）2hq、Gd（sal）2hq的MIC 分別位于0.50～0.25，1.00～0.50 mmol／L，配體8－羥基喹啉的MIC位于0.50～0.25mmol／L。

表3 藥品的最小抑菌濃度Table 3 The minimum inhibiting concentration of drugs

圖1 兩種三元配合物及8－羥基喹啉的濃度與抑菌圈直徑關(guān)系Figure 1 ACD of RE（sal）2hq（RE ＝Pr，Gd）and 8－h(huán)ydr oxylquinoline with different concentration

2.3 藥品的最小殺菌濃度

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)24h后測(cè)得各藥品的MBC，結(jié)果見(jiàn)表4。

配合物Gd（sal）2hq的MBC 測(cè)定部分試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，藥品濃度為3 mmol／L 時(shí)所長(zhǎng)菌落數(shù)小于5。因此，Gd（sal）2hq的MBC為3mmol／L。

表4 藥品的最小殺菌濃度Table 4 The minimum bactericidal concentration of drugs

圖2 轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的黑曲霉生長(zhǎng)情況Figure 2 The situation of Aspergillus nigerafter the transfer

2.4 配合物的持久穩(wěn)定性

試驗(yàn)中對(duì)照組1，在培養(yǎng)15h后長(zhǎng)滿白色菌絲，隨即開(kāi)始第一次測(cè)量抑菌圈直徑D。通過(guò)每間隔2h再次測(cè)量抑菌圈直徑來(lái)探究藥品抑菌能力的持久性。培養(yǎng)24h后，對(duì)照組1平板布滿黑色孢子，抑菌圈直徑基本趨于恒定。繼續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48，72，96h后抑菌圈直徑均無(wú)明顯變化。結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）抑菌圈直徑隨時(shí)間的變化趨勢(shì)較小，而配體8－羥基喹啉抑菌圈直徑則發(fā)生了很大的變化，由最初的強(qiáng)抑菌活性轉(zhuǎn)變?yōu)槿跻志钚浴?/p>

表5 抑菌圈隨時(shí)間變化情況Table 5 The changing of ACD with different incubation time ／mm

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，得到抑菌圈直徑隨時(shí)間變化關(guān)系，見(jiàn)圖3和圖4。

由圖3和圖4可知，配體的抑菌能力不斷降低，而配合物抑菌效果好且具有抑菌持久穩(wěn)定性。其原因可能是稀土離子與其配體以配位鍵相結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，而導(dǎo)致其在抑菌過(guò)程中產(chǎn)生緩慢釋放效應(yīng)，從而產(chǎn)生比其配體更加穩(wěn)定持久的抑菌效果。

圖3 藥品濃度為8mmol／L時(shí)抑菌圈隨時(shí)間變化情況Figure 3 The changing of ACD with different time，when the concentration of drugs are 8mmol／L

圖4 藥品濃度為4mmol／L時(shí)抑菌圈隨時(shí)間變化情況Figure 4 The changing of ACD with different time，when the concentration of drugs are 4mmol／L

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)以水楊酸（Hsal）、8－羥基喹啉（Hhq）及其稀土三元配合物等為材料，采用杯碟法研究對(duì)黑曲霉的抑菌作用、及抑菌持久穩(wěn)定性。結(jié)果表明：水楊酸沒(méi)有抑菌作用，8－羥基喹啉抑菌作用較強(qiáng)，但抑菌效果隨時(shí)間的推移明顯減弱。抑菌作用不明顯的稀土（RE ＝Pr、Gd）離子與配體形成配合物后，其抑菌效果明顯增強(qiáng)且具有持久穩(wěn)定性。配合物Pr（sal）2hq、Gd（sal）2hq和配體8－羥基喹啉的最小抑菌濃度分別為0.50～0.25，1.00～0.50，0.50～0.25mmol／L；最小殺菌濃度分別為2，3，5mmol／L。此研究成果期望能為研制新型的黑曲霉抑菌劑和拓寬稀土資源的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路和方向。

（2）稀土離子不能進(jìn)入正常的細(xì)胞內(nèi)［13］，致使單獨(dú)的稀土離子抑菌效果不明顯。而稀土離子與配體形成配合物后，所帶的正電荷部分轉(zhuǎn)移到配體上，使螯合環(huán)上的電子產(chǎn)生離域效應(yīng)，導(dǎo)致稀土離子極性降低，脂溶性增強(qiáng)，配合物能更好的穿透微生物細(xì)胞膜的類脂層［14］，配合物穿過(guò)細(xì)胞保護(hù)層后，在稀土離子與配體的協(xié)同作用下，細(xì)胞內(nèi)外正常的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)被阻斷，細(xì)胞的一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性失去了整體調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)外正常的生理代謝過(guò)程也必將受到影響，從而達(dá)到抑菌的效果。兩種稀土配合物對(duì)黑曲霉的抑菌作用強(qiáng)，且強(qiáng)于其配體，很有可能是由上述原因所致。

（3）在日常生產(chǎn)生活中，只有強(qiáng)而穩(wěn)定的抑菌劑才能徹底解決由黑曲霉帶來(lái)的食品腐敗、機(jī)械霉變和木材防腐等問(wèn)題。試驗(yàn)結(jié)果表明：稀土水楊酸8－羥基喹啉三元配合物的抑菌能力強(qiáng)，且與其配體相比具有更好的抑菌持久穩(wěn)定性，滿足抑菌劑穩(wěn)定性的要求。在藥品研發(fā)的過(guò)程中藥品的低毒性是一個(gè)很重要的標(biāo)準(zhǔn)。資料［15］表明，稀土配合物比許多有機(jī)合成藥物或過(guò)渡金屬配合物的毒性低，通過(guò)口服或外用稀土配合物未發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)積累，符合藥品研制的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，中國(guó)稀土資源極為豐富，為合成稀土配合物提供了廉價(jià)的原材料，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

本試驗(yàn)研究成果旨在為研制新型的黑曲霉抑菌劑和拓寬稀土資源的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路和方向。至于兩種稀土配合物能否作用于其它有害病菌以及其相關(guān)應(yīng)用，還有待進(jìn)一步探討和研究。

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