真菌多糖定量檢測方法研究進展

趙 艷 畢榮宇 牟德華

（河北科技大學，河北 石家莊 050018）

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發酵液中提取出來的，由10個以上單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物［1］。具有抗感染、抗輻射、降血糖、治療腫瘤等多種生物活性，被稱 為“生 物 應 答 效 應 物”（biological response modifier，BRM）［2］。目前，真菌多糖已成為食品科學、分子生物學、醫藥學等領域研究的熱點之一，而多糖的定量分析檢測是這些研究的基礎。隨著分析檢測技術的發展，多糖的檢測技術呈現多元化，正朝著便捷、精確的方向發展。多糖定量檢測方法包括比色法、色譜法、分子光譜法等［3－5］。

傳統測定多糖含量的方法是比色法，該方法的基礎是使多糖降解后與特定物質發生顯色反應，在最大吸收波長下測定吸光值，進行定量測定。這種方法操作簡便，易于實現。常用的比色法是苯酚－硫酸法，該方法穩定性良好、重現性高，是一種精確的測定多糖含量的方法。色譜法測定多糖含量包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）等［3］，這些方法主要用于組成多糖的單糖定量、定性分析，其應用使得多糖的結構分析、性能研究有了進一步發展。

應用以上方法需要對多糖進行復雜的處理，如：多糖的降解、單糖的衍生化；同時對色譜柱、檢測器等要求較高，如果只是簡單的定量分析，可以選用快速、操作簡單的方法，如：剛果紅檢測法［6］、共振光散射法［7］。剛果紅是一種染料，其可與β－葡聚糖發生特異性結合，使待測溶液的最大吸收峰發生紅移，然后再根據吸光值和不同濃度多糖溶液的線性關系進行定量分析。多糖屬于大分子物質，有機染料在多糖表面發生堆積時可導致體系共振光散射信號的增強，通過增強的信號可對多糖進行含量測定。

1 比色法

比色法是一種傳統的測定多糖含量的方法，其基本原理是［8］：用硫酸或鹽酸處理多糖，使多糖在強酸中脫水生成糠醛或其衍生物，然后利用紫外－可見分光光度計測定反應溶液的吸光值，結合標準曲線，進行多糖的定量測定。常用的比色法有苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、地衣酚－硫酸法等。

其中苯酚－硫酸法是應用最為廣泛的一種方法，苯酚硫酸法的具體原理為［9］多糖和寡糖被濃硫酸水合產生的高溫水解成單糖，單糖在強酸條件下又與體系中的苯酚發生顯色反應，生成橙色衍生物，該衍生物在波長490nm 處具有最大吸收峰。在一定范圍內，吸收值與糖濃度呈現線性關系，因此可以進行定量測定。精密度試驗、穩定性試驗、重現性試驗等都表明苯酚－硫酸法是一種使用性廣、精確度高、穩定性好、重現性好的測定真菌多糖的方法［10－12］。

孫國琴等［12］對苯酚－硫酸法測定杏鮑菇多糖進行了研究，并對該方法的測定波長、顯色溫度、顯色時間、苯酚用量進行了優化，優化之后加樣回收率達到99.16%，RSD 為1.16%。顯色液在120min內穩定，說明這種方法精確度高、穩定性好。

何新益等［13］采用改良的苯酚－硫酸法測定了苦瓜提取物中的多糖含量，該方法以混合單糖代替葡萄糖作為對照，制作標準曲線，消除了單一以葡萄糖為對照造成的系統誤差。結果表明，糖濃度在20～100μg范圍內該方法線性關系良好；該法的平均回收率達100.68%，其供試液在2h內顯色穩定。

多數情況下采用苯酚－硫酸法時，一般都用紫外－可見分光光度計，當樣品數目較多時，操作就很繁瑣，同時由于儀器不穩定帶來的誤差就無法避免。近年來，有學者開始使用酶標儀進行相關物質的測定［14－17］，該儀器可以同時處理十幾甚至幾十個樣品，具有快速、便捷、精確度高等優點。楊定清等［14］使用多功能酶標儀代替紫外－可見分光光度計對香菇總糖含量進行了測定，研究表明該方法可以實現對樣品的快速測定，所需試樣量小，是一種理想的測定香菇中總糖含量的方法。

2 色譜法

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法測定糖類始于1958年，該方法具有選擇性強、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優點，近年來，因毛細管色譜柱和程序升溫技術的普遍使用，糖類的氣相色譜測定方法得到更廣泛的應用［8］。另外，氣相色譜與質譜聯用可以得到有關單糖殘基類型、鍵連接方式、糖的序列、糖環的形式、聚合度等多種結構信息［18］。

糖類物質本身沒有足夠的揮發性，在進行氣相檢測時，必須先對其進行衍生化，使其轉化為易揮發、對熱穩定的衍生物，再進行檢測。目前常用的衍生物有三甲基硅烷化衍生物、三氟醋酸酯衍生物、糖醇醋酸酯衍生物、糖肟和糖腈衍生物［8，19，20］。在某些衍生物制備過程中，會生成衍生物的異構體，在進行氣相檢測時會生成干擾峰，因此在進行衍生化時，應根據具體的物質，選擇合適的衍生物制備方法，使每種單糖分離出單一的色譜峰。

高庚申等［19］采用預衍生化－毛細管柱氣相色譜法對單糖進行了測定，并對5種毛細管柱和3種衍生化方法進行了綜合比較，選出了2種分離效果較好的毛細管柱，同時發現糖腈乙酰化反應操作簡便，避免了由于生成異構體和歧化反應出現的多峰現象，這種衍生化方法更適合單糖的氣相色譜定量分析。應用該方法測定了7種單糖，其分析響應信號與濃度均保持一定的線性關系。

李小定等［21］將提取純化的4 種灰樹花多糖級分用2mol／L的三氟乙酸在110 ℃下水解2h，然后將降解成的單糖制成乙酰酯生物，再選用毛細管色譜柱進行單糖的分離，測出了4種多糖級分的單糖組成，回收率試驗結果顯示平均回收率在98.5%～101.6%，表明該方法有較高的回收率，方法穩定性良好。

朱彩平等［22］對提取的枸杞多糖進行了水解、單糖糖腈乙酰化處理，然后進行氣相色譜分析，結果表明，枸杞多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖組成，其 含 量 分 別 為5.59%，45.57%，4.07%，1.85%，7.83%，35.07%。

2.2 液相色譜法

2.2.1 可見光檢測法 糖類物質不具有紫外吸收，較早期選用液相法檢測糖類物質時，需配備特定的檢測器，最常用的是示差檢測器，這種方法無需對糖類物質進行衍生化，相對來說比較簡單［20］。謝明勇等［23］選擇示差折光檢測器，以蒸餾水為流動相，用高效液相色譜法對茶葉多糖的含量進行了測定。研究過程中他們以自制的茶葉多糖純品作為標準品，繪制了標準曲線，以此為基礎對多種茶葉中多糖的含量進行了測定，結果表明該方法簡單、準確、可靠，適合于作為茶葉多糖原材料和產品質量控制的方法。韓振泰等［24］選用專用的糖分析柱，以分子量為104的葡聚糖為標品，使用示差折光檢測器，對靈芝多糖的含量進行了測定，方法回收率為98%～104%，相對標準偏差為0.12%，表明該方法是一種準確性好、精密度高的測定靈芝多糖的方法。

除了示差檢測器外，還有學者選用普通的紫外－可見分光光度計進行多糖含量的測定。木海鷗等［25］將提取自人參渣的多糖進行水解，然后選擇紫外－可見分光光度計對其含量進行了液相檢測。在進行定量檢測時，選擇D－無水葡萄糖作為對照品，先對該單糖在紫外區的最大吸收波長和出峰時間進行了確定，然后對人參多糖水解后的單糖進行了測定。試驗結果表明，葡萄糖質量濃度在0.5～10.0 mg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好，精密度、穩定性、重復性、加樣回收率試驗也說明該法可靠、靈敏度高，可用于人參渣中多糖含量的測定。

2.2.2 紫外衍生法 雖然選用示差折光檢測器對多糖進行液相檢測操作比較簡單，但示差檢測器靈敏度低、易受流速、壓力和組分改變的影響［8，19］。近年來出現了一種新的方法——衍生法，其原理是利用衍生化試劑處理多糖，使其變成具有對紫外或熒光敏感的衍生物，進而使用常用的紫外－可見分光光度計或者熒光檢測器進行檢測。該法又分為柱前衍生和柱后衍生兩種，常用的是柱前衍生法，即：分離前預先將樣品轉化為衍生物，然后進行分離、檢測。常用的糖類紫外衍生化試劑有：2，4－二硝基苯、對甲氧基苯胺、2－氨基吡啶、6－氨基喹啉、苯甲酸、對氨基苯甲酸乙酯、吡唑啉酮，其中最常用的是吡唑啉酮試劑；常用的熒光檢測衍生試劑有［20］：3－（4－羧基苯甲酰基）－2喹啉羧基醛（CBQCA）、2－氨基吖啶（2－AA）、8－氨基萘－1，3，6－三磺酸（ANTS），1－氨基芘－3，6，8－三磺酸（APTS）等。

目前多糖測定常用的方法是：選用1－苯基－3甲基－5吡唑啉酮（PMP）作為衍生試劑，對多糖進行柱前衍生，然后進行液相紫外檢測，研究表明這種方法可以快速、有效地分離單糖組分，這種方法精確度高、穩定性良好、重現性好［26－30］。楊興斌等［26］采用PMP 對10 種標準單糖進行衍生化，在40min內實現了10種單糖的分離，重復性試驗結果表明，其可重復性范圍為94.6%～108.0%，相對偏差低于4.9%，該方法適用于絞股藍茶多糖的分離鑒定，同時，研究過程中用三乙胺作為流動相改良劑，分離效果明顯提高。戴軍等［27］采用柱前衍生高效液相色譜法對杜氏鹽藻多糖的單糖組成進行了測定，他們對衍生化條件和水解條件進行了優化，同時對液相條件（乙腈的百分含量，磷酸鹽的pH 值）進行了優化，結果表明這種柱前衍生法對于單糖的檢測有較高的準確度，杜氏巖藻多糖主要是由葡萄糖和半乳糖組成的。

2.3 高效薄層色譜法

傳統的薄層色譜法是將樣品點到平板上，用展開劑進行展開，然后用顯色劑進行顯色，將顯色后的斑點與已知標品進行比較定性分析，將斑點洗脫下來后進行掃描等處理可進行定量分析。現在，所說的薄層色譜法是指高效薄層色譜法，隨著薄層色譜掃描儀的出現，薄層色譜法變得越來越快捷、方便。

Eliza Malinowska等［31］采用薄層色譜法對猴頭菇多糖進行了測定，研究過程中使用一次性微型定量吸管吸取3μL的樣品在硅膠板上進行點樣，然后用苔黑酚－硫酸進行原位乙酰化，顯色之后用雙波長進行掃描檢測，與傳統的顯色方法相比，這種方法的線性范圍更為廣泛，也更加靈敏和迅速。

鄧國棟等［32］采用雙波長薄層色譜掃描法測定了茶多糖的單糖組成，使用硫酸將茶多糖進行水解，水解后的單糖再進行層析，然后利用薄層掃描儀進行掃描，將水解的單糖與幾種標準品比對進行定性，采用外標法進行量的測定，該方法對阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的線性范圍為1 200～7 200μg；4種單糖的回收率分別為97.6%，98.5%，98.1%，95.9%，說明這種方法具有良好的準確性。

萬仁玲等［33］建立了一種控制黃芪多糖粗粉質量的方法，用苯酚－硫酸法測定黃芪多糖粉中總糖的含量，用薄層色譜半定量法測定黃芪多糖粗粉中低聚糖的含量，專屬性驗證表明，應用此法對葡萄糖和蔗糖進行鑒別時，不會受多糖類和皂苷類物質的干擾，同時，穩定性、重復性、加樣回收率結果也表明該方法有良好的準確性，可作為檢測黃芪多糖粗粉質量的有效方法。

以上幾種方法都屬于多糖定量測定的間接方法，都是在多糖降解為單糖之后進行測定的。下面介紹幾種利用多糖和相關物質發生反應，然后進行定量測定的直接檢測方法。

3 剛果紅檢測法

剛果紅檢測法特別適用于具有β－三股螺旋結構的葡聚糖的定量測定。剛果紅是一種染料，β－葡聚糖與剛果紅發生特異性結合時會導致剛果紅的最大吸收峰發生紅移，即向長波長方向移動，且多糖濃度在一定范圍內時，剛果紅熒光吸收值的增加與多糖濃度的增加成線性關系，據此可以對β－葡聚糖進行定量測定［6，34］。Helga Moleken等［6］使用此方法測定了β－葡聚糖的含量，研究過程中對剛果紅的濃度進行了優化，結果表明當剛果紅的濃度為0.08%時，這種方法有較高的靈敏度。杜先鋒等［35］采用剛果紅法測定了燕麥中β－葡聚糖的含量，同時研究了pH 值、時間、溫度、雜質等因素對測定結果的影響，確定了最佳反應pH 值、時間和溫度，并且添加的一些雜質如可溶性淀粉、酪蛋白等對測定結果均無影響，說明剛果紅與β－葡聚糖有較高的專一性結合。

4 共振光散射法

共振光散射技術的原理是［36］：有機染料在蛋白質、核酸等生物大分子上進行堆積導致強烈的共振光散射增強，信號的增強與生物大分子濃度具有線性關系，據此可進行物質的定量分析，這種技術使用普通的熒光分光光度計即可，具有便于操作的優勢［30］。多糖分子屬于天然的大分子物質，也可以采用共振光散射法這一新穎的測定技術。王元鳳等［7］利用共振光散射法對茶多糖的含量進行了測定，研究表明向氯化十六烷基吡啶－氫氧化鈉（CPC－NaOH）體系中添加茶多糖TPS時，體系的共振光信號明顯增強。TPS的濃度為2.0～20.0μg／mL時，共振光信號的增強與多糖的濃度呈線性關系，這種方法便于操作，且具有較高的選擇性和穩定性，具有明顯的優勢。

從以上介紹的幾種方法可以看出，對于真菌多糖的定量測定，這些方法各有各的特點。傳統的比色法操作簡便，可實現多糖含量的快速測定。氣相色譜、高效液相色譜法，需要對樣品進行復雜的衍生處理，操作相對繁瑣，但這些方法可實現多糖的單糖組成測定、結構分析等復雜研究。剛果紅檢測法和共振光散射法則是利用多糖屬于大分子這一特性，實現對其定量檢測。同時，這些方法具有一定的針對性，如：剛果紅染料專一地與具有三股螺旋結構的多糖分子發生結合，可實現具有該結構的多糖分子的檢測。

多糖作為一種大分子物質，其生物活性與其含量、分子結構、單糖組成等有密切關系［37］。這些結構與活性關系的研究，即構效關系研究，都是以文章提到的這些方法為基礎的，隨著技術的發展，多糖的定量測定方法日趨多元化，為研究人員提供了更多的選擇余地，同時先進儀器設備的推出，使得操作越來越簡便，結果越來越精確，為多糖的進一步研究奠定了良好的基礎。

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