丹皮酚對大腸癌細胞端瞄聚合酶的影響

夏士濤，譚詩云，朱衛芳，劉長青

1.武漢大學人民醫院消化內科，湖北 武漢 430060;2.荊門市第一人民醫院消化內科

1998年Smith等利用TRF1(端粒重復序列結合因子1)在酵母雙向雜交實驗誘導而發現的一種新的端粒相關蛋白－端錨聚合酶(TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase，Tankyrase)［1］，其主要功能之一是通過對TRF1的糖基化修飾調節端粒長度，在腫瘤的發生過程中起作用［2］，Tankyrase1有望成為繼端粒酶后，對細胞的生長、衰老、癌變起極其重要作用的調控因子［3-4］。前期研究發現丹皮酚具有體外抗大腸癌細胞的作用［5］，然而丹皮酚對大腸癌細胞Tankyrase1表達的影響目前尚不十分清楚，本研究對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人結腸癌:HT-29細胞株購自中南大學腫瘤研究所，正常人結腸細胞:NCM460細胞系購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.2 主要試劑:丹皮酚注射劑:上海第一制藥廠(10 mg/2 mL，批號:990402)，臨用前用 RPMI 1640培養液稀釋成終濃度為3.91～250 mg/L;RPMI 1640培養基:美國GIBCO公司產品;小牛血清:杭州四季青生物材料研究所提供;瓊脂粉:武漢亦新生物技術有限責任公司;胰酶:武漢亦新生物技術有限責任公司;逆轉錄反應緩沖液:Promega，Oligo(dT)18上海生工生物工程技術服務有限公司，dNTPmix華美生物工程公司;RNase inhibitior:華美生物工程公司;Taq酶:上海賽百盛生物技術有限公司;PCR反應緩沖液:上海賽百盛生物技術有限公司;50 bp GeneRuler DNA Ladder:上海賽百盛生物技術有限公司，100 bp GeneRuler DNA Ladder:上海賽百盛生物技術有限公司;TBE緩沖液:DecentBio。引物:Tankyrase1上游引物5'－CTCTCCTGGCTGTTCTTTGG －3'，下游引物 5'－ATCGGGCACTCGTCTGTAAC －3'，PCR產物長度為188 bp，由上海賽百盛基因技術有限公司合成特異性內參β-action:上游引物5'－GCGCTCGTCGTCGACAACGG －3'，下游引物5’－GTGTGGTGCCAAATCTTCTCC －3'，PCR 產物長度為238 bp，由上海賽百盛基因技術有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設備:PCR基因擴增儀(PTC100/PE9700):Biometra，電泳儀:上海復日科技有限公司;電泳成像拍照(EDAS290):Vilber Lourmat，PCR primer design software(Primer 5):PREMIER Biosoft International，UV-1700 pharmaspec UV-visible spectrophotometere:SHIMADZU。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:將正常大腸細胞和HT-29細胞培養在含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中，加人青霉素100 u/L，鏈霉素100 u/L，置37℃，5%CO2培養箱內培養，每3～4 d用0.25%胰酶消化傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組:有正常大腸細胞和大腸癌細胞兩種細胞株，分別給兩種細胞株加入不同濃度的丹皮酚，以加入等量的細胞培養液為對照組，這樣實驗分成四組:第一組為大腸癌細胞，第二組為加入丹皮酚的大腸癌細胞，第三組為正常大腸細胞，第四組為加入丹皮酚的正常大腸細胞。丹皮酚的濃度分度分別為3.91 mg/L、7.81 mg/L、15.63 mg/L、31.25 mg/L、62.5 mg/L、125 mg/L、250 mg/L，對每一組培養24 h、48 h、72 h、96 h后分別提取總mRNA。

1.2.3 總 RNA的提取:取培養瓶中的細胞液置入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，冰上劇烈震蕩混勻;將溶液置于室溫5 min，以徹底降解核蛋白產物，加預冷的0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min;4℃離心，12000 r/min×15 min，仔細吸取上層水相，移至另一新EP管，加入0.4 mL冰冷異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min，4℃離心，12000 r/min×10 min，棄上清，加入冰冷的75%乙醇0.8 mL，混勻洗滌RNA 10 min，4 ℃離心，10000 r/min×3 min，棄上清，管口敞開，室溫干燥RNA 10 min，使乙醇揮發;加入20 μL DEPC處理的無菌水，槍頭輕輕混勻幾次，55～60℃孵育20 min以溶解RNA。

1.2.4 RNA純度和濃度檢測:比色皿用95%的酒精洗兩遍，再用DEPC水洗兩遍后加入3 mL DEPC水調零，再加入5 μL RNA混勻，應用UV 240型紫外分光光度儀測定核酸吸光度 A260和 A280值。計算A260/A280，其值應在 1.8～2.0之間，如果比值 ＞2.0，說明 RNA 可能降解;如果比值 ＜1.8，說明有蛋白質和DNA等雜質殘留。按OD260=1時RNA含量約為40 μg/mL的標準計算RNA濃度。取A260/A280比值＞1.80者分為2 μL/管，－75℃保存備用。

1.2.5 逆轉錄反應:引物OD值為10D，短暫離心后用無菌雙蒸水溶解稀釋為10 pmol/μL，小量分裝儲存于－75℃冰箱。由細胞株提取的總RNA兩步法擴增DNA目的片斷。RT反應(20 μL體系):DEPC處理過的無菌0.2 mL薄壁 EP管置于冰上，其中混合:總RNA(0.5 μg/μL)2 μL;Oligo(dT)18 Primer(0.5 μg/μL)1 μL;DEPC 水7 μL;輕輕混勻，離心 5 s;將混合物置于70℃下5 min，迅速置于冰上冷卻，短暫離心;將混合物置于冰上，并依次加入下列試劑:5×Buffer 4 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;RNase inhibitor(20 u/μL)1 μL混勻，稍離心，將混合物置于37℃下5 min;向混合物加入 MMLV(200 u/μL)1 μL，終體積為 20 μL，上PCR儀，在42℃孵育60 min逆轉錄;再放入70℃孵育10 min以終止反應;并在4℃保溫，防止二級結構形成;并分裝2 μL/管，－20℃保存備用。PCR反應:無菌0.2 mL薄壁EP管，依次加入以下試劑:cDNA 1.5 μL;上游引物(10 pmol/μL)1 μL;下游引物(10 pmol/μL)1 μL;10 × Buffer 2.5 μL;Mg2+(20 mmol/L)1.5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL;無菌雙蒸水 14 μL;Taq 酶 (1 u/μL)1 μL;終體積為 25 μL;反應條件:預變性95℃ 10 min，變性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，一共循環45次;72℃5 min終止反應，最后4℃保存，－20℃冰箱保存待測。PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳:加5 μL PCR反應產物及1 μL溴酚藍于點樣孔，電泳50～80 V(5 V/cm)，20 min，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于EDAS290電泳成像儀中拍照并用Kodak1D 3.5專用軟件進行圖像分析，記錄結果。Tankyrase1的相對表達量分別以其PCR產物的A值與β-actin PCR產物A值之比計算。

1.2.6 RNA 凝膠電泳:取1 μL 的總 RNA 在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，確定RNA的質量和完整性。真核細胞的28S/18S的比值約為2∶1，如果比值逆轉，則表明RNA降解。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計。實驗數據以表示，單一兩組均數之間進行t檢驗，多組間均數以方差分析(ANOVE)進行組間比較，均數之間的多重比較以SNK進行q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA測定結果 本實驗抽提的四組細胞中總RNA，電泳結果可見清晰的28S、18S和5S條帶，說明所提取的總RNA樣本無降解，質量良好。

2.2 RT-PCR的結果 經RT-PCR擴增后Tankyrase1基因轉錄本片段大小為與理論值相符。

實驗結果表明:(1)RT-PCR擴增的Tankyrase1 cDNA產物(目的基因與內參拷貝數的比值)在大腸癌細胞中的表達(0.875±0.037)比在正常對照組升高(0.1532 ±0.108)(P ＜0.05)，而在給予丹皮酚干預后的Tankyrase1(0.356 ±0.018)表達較下降(P ＜0.05)，但在正常大腸細胞組(0.1532 ±0.108)與正常細胞加丹皮酚組中(0.2379±0.012)并未出現這種顯著性的改變(P＞0.05)。丹皮酚在15.63～250 mg/L濃度范圍內對HT-29細胞中Tankyrase1 mRNA的表達有影響。

3 討論

近年多種研究表明非甾體類抗炎藥(NSIADs)如阿司匹林等能減少人類和實驗動物大腸癌的發生［6］，但長期應用時不良反應較多，最常見的是胃腸道反應，可出現胃潰瘍或胃出血，因而限制了其在臨床上的廣泛使用。

丹皮酚為中藥牡丹皮的主要活性成分，藥理研究表明，牡丹皮的有效成分具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用［7-8］，如解熱鎮痛、抗炎、免疫調節、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等，且其副作用小，在臨床上可大劑量使用。

本實驗研究發現，丹皮酚在3.91～250 mg/L的4個濃度下，在 3.91 mg/L濃度下大腸癌細胞中Tankyrase1 mRNA表達與未加丹皮酚組相比，無顯著性差異(P＞0.05)，后三者與未加丹皮酚組相比，有顯著性差異，且有明顯的濃度效應和時間效應關系。推測在丹皮酚作用下，大腸癌HT-29細胞的Tankyrase1 mRNA表達下調，已發生二磷酸腺苷核化的TRF1去糖基，再次恢復與端粒與端粒DNA結合的能力，使端粒處于“結合”狀態，當與端粒DNA結合的TRF1到一定數目時，這個數目取決于丹皮酚的濃度和作用時間，達到臨界數時，就抑制調節端粒長度的“蛋白計數”機制從而抑制端粒酶端粒，端粒延長終止。

［1］Smith S，Giriat I，Schmitt A，et al.Tankyrase，a Poly(ADP-Ribose)Polymerase at Human Telomeres［J］.Science，1998，282(11):1484-1487.

［2］Ancelin K，Brunori M，Bauwens S，et al.Targeting assay to study the cis functions of human telomeric proteins:evidence for inhibition of telomerase by TRF1 and for activation of telomere degradation by TRF2［J］.Mol Cell Biol，2002，22(5):3474-3487.

［3］Chen H，Li Y，Tollefsbol TO.Poly(ADP-ribose)polymerase inhibitors:new pharmacological functions and potential clinical implications［J］.Curr Pharm Des，2007，13(9):933-962.

［4］Mc Cabe N，Cerone MA，Ohishi T，et al.Targeting Tankyrase1 as a therapeutic strategy for BRCA-assiciated cancer［J］.Oncogene，2009，28(11):1465-1470.

［5］Liu CQ，Tan SY，Ji CY，et al.The effects of paeonol on inhibiting the proliferation of human colorectal cancer cell line HT-29 and its molecule mechanism ［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2005，21(10):1251-1524.劉長青，譚詩云，計春燕，等.丹皮酚對大腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用及其機制的探討［J］.中國藥理學通報，2005，21(10):1251-1254.

［6］Luo HS.Reconstruction chemoprevention of digestive cancer［J］.Chin J Dig，2005，25(3):129-130.羅和生.重視消化系統腫瘤的化學預防［J］.中華消化雜志，2005，25(3):129-130.

［7］Li QA.The Study of paeonol in pharmacological［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，1988，19(6):36.李群愛.牡丹皮的藥理研究［J］.中草藥，1988，19(6):36.

［8］Zhang LH，Shang PG，Huang Y，et al.Progress in pharmacological and clinical studies of the paeonol［J］.Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，1996，16(3):187-190.章靈華，尚培根，黃藝，等.丹皮酚的藥理與臨床研究進展［J］.中國中西醫結合雜志，1996，16(3):187-190.