山東地區漢族骨髓捐獻者HLA-DRB1基因分型及多態性分析

申 華，莊云龍，王 靜，林 明，孫桂芝，喬文本

(山東省血液中心，濟南250014)

人白細胞抗原(HLA)位于6號染色體短臂區域，是由一組緊密連鎖的基因座所組成的具有高度多態性的遺傳復合體。HLA是人類重要的遺傳標志，在抗原識別、呈遞、T細胞分化與活化、調節免疫細胞相互作用等方面起著非常重要的作用，也是影響造血干細胞和器官移植成敗及長期存活的關鍵因素之一。由α和β鏈組成的HLA-DR分子是細胞表面的糖蛋白，是HLA二類分子的一種。目前發現DRB1等位基因有1 094個，具有豐富的多態性。DR分子主要存在于B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞以及活化T淋巴細胞等免疫細胞上，它能夠結合抗原肽并且將自身和非己抗原遞呈給CD+4T細胞，在抑制和調節免疫反應中起著至關重要的作用。HLA-DR分子不僅與供、受體配型有關，而且其不同等位基因與自身免疫性疾病、炎癥和感染性疾病的發生密切相關［1～4］。2010年7月28日～10月26日，我們采用聚合酶鏈反應—測序為基礎的分型方法(PCR-SBT)，對909例山東地區漢族骨髓志愿捐獻者進行了 HLA-DRB1基因分型，分析其HLA-DRB1等位基因的多態性及其分布特點，以便于為需要接受器官移植者尋找合適供者，也為后續進行HLA-DRB1基因多態性與疾病發生的相關性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 自中華骨髓庫山東分庫內隨機選取909例山東漢族骨髓志愿捐獻者(男460例、女449例，年齡23～45歲)的EDTA抗凝全血。

1.2 HLA-DRB1等位基因檢測方法 利用EZ Bead system-32 DNA提取工作站提取山東漢族骨髓志愿捐獻者血液的DNA并測定260、280 nm處的光密度值(OD260、OD280值)，調整DNA濃度。以提取的DNA為模板(終濃度2 ng)，加Taq酶(0.0375 U)和包含引物(1 μM)等混合物共10 μL。用PCR反應體系擴增HLA-DRB1基因的外顯子和內含子序列。PCR擴增反應參數:96℃ 2 min，1個循環; 96℃30 s，65℃ 30 s，5個循環;72℃ 120 s，96℃30 s，62℃ 30 s，35個循環;72℃ 120 s，10℃ 4 h。反應結束后取2.5 μL擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠上進行檢驗。參照瓊脂糖凝膠電泳結果中的陽性條帶，在相應PCR擴增產物的EP管內加入Fast AP(1 U/μL)0.8 μL和Exonuclease I(20 U/μL) 0.2 μL，混勻后于PCR儀中37℃ 15 min、85℃ 15 min。依照電泳圖稀釋PCR產物后將各位點PCR產物1 μL分別轉移到標記好的擴增板對應位置，取380 μL(配100個 PCR混合物)各種 Sequencing Primer Mix，分別置于16個1.5 mL潔凈的離心管內，再分別加入20 μL的BigDye，混勻后取各混合物4 μL，加入到對應擴增板孔，共5 μL的PCR反應體系，雙向單鏈擴增HLA-DRB1基因的2/3外顯子。Sequencing PCR反應參數為96℃ 1 min，1個循環; 96℃100 s，60℃120 s，40個循環;10℃4 h。擴增結束后，向每孔中加入125 mM的EDTA 2.5 μL，混勻后，加入15 μL無水乙醇，再充分混勻，室溫避光10 min。2 250 g離心30 min。將擴增板倒置于吸水紙上，180 g離心1 min。70%乙醇洗滌干燥后，向每孔中加入10 μL甲酰胺，置3730測序儀上檢測。測序后導出的結果用專用軟件分析，依據的HLA數據庫版本為08/13/10。觀察HLA-DRB1的基因頻率以及比較不同國家和地區人群HLA-DRB1等位基因分布。

1.3 統計學方法 用直接計數法得到HLA-DRB1等位基因的觀察數，并計算各等位基因頻率。不同人群間HLA-DRB1等位基因頻率分布比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山東地區漢族骨髓志愿捐獻者HLA-DRB1等位基因頻率 909例山東地區漢族骨髓志愿捐獻者共檢出42種HLA-DRB1等位基因，其頻率及血清學組特異性見表 1。其中，HLA-DRB1*0901 (16.28%)、HLA-DRB1*1501(15.13%)和HLADRB1*0701(14.04%)基因頻率較高，基因頻率較低的位點分別是HLA-DRB1*0408、HLA-DRB1* 0809、HLA-DRB1*1103、HLA-DRB1*1303、HLADRB1*1412、HLA-DRB1*1425和HLA-DRB1* 1601，各占0.06%。

2.2 山東地區漢族骨髓志愿捐獻者與其他地區、種族人群的HLA-DRB1等位基因頻率比較 山東漢族骨髓志愿捐獻者 HLA-DRB1*0901的頻率(16.28%)與新疆維吾爾族(1.92%)［5］、韓國人(9.18%)［6］和德國人(0.97%)［7］相比，P均 ＜0.05。山東骨髓志愿捐獻者的HLA-DRB1*1501的頻率(15.13%)與江蘇(10.79%)［8］、湖北(9.97%)［9］、廣東漢族(8.33%)［10］，新疆維吾爾族(8.65%)、韓國人(7.42%)和日本人(8.90%)［9］相比，P均 ＜0.05。山東骨髓志愿捐獻者 HLADRB1*0701的頻率(14.04%)與湖北漢族(0)、廣東漢族(4.17%)、韓國人(7.22%)和日本人(2.30%)相比，P均＜0.05。

3 討論

HLA的分型方法經歷了血清學分型、細胞學分型和基因分型。前兩種方法由于技術上的缺陷，存在操作復雜、分型不準確的缺點，已經逐漸被淘汰?；蚍中头椒ㄓ纸洑v了PCR序列特異性引物(PCRSSP)、PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSOP)、基因芯片和PCR-SBT等。PCR-SSP和PCR-SSOP對新近發現的等位基因無法得出準確結果。PCR-SBT直接對HLA基因的DNA進行測序分析，具有分型準確、分辨率高的特點，可以確定新的等位基因，成為HLA分型的金標準，是目前最先進的測序分型技術。本研究利用該技術對909例山東漢族骨髓志愿捐獻者的HLA-DRB1位點進行高分辨分型，共檢出HLA-DRB1等位基因42種，其中分布頻率位于前6位的等位基因(HLA-DRB1*0901、1501、0701、1202、0803、1101)累計頻率為66.07%，表明山東漢族人群中雖然HLA-DRB1多態性較為豐富，但常見等位基因的分布仍比較集中，攜帶這些常見等位基因的器官移植受者較易找到與之相配的供者。器官移植及造血干細胞移植成功的關鍵在于找到與HLA高分辨分型相配合的供者［11］。研究［12］表明，HLA-DRB1等位基因不同與非親緣性臍血移植時移植物抗宿主病(GVHD)發生率之間存在顯著相關性，而且DRB1不相合與受體存活期縮短密切相關。在非親緣性臍血移植HLA分型中，對HLA-DRB1位點高分辨分型技術的應用可以顯著降低受體GVHD的發生率［13］。由此可見，HLA-DRB1等位基因高分辨準確分型對于器官移植、組織配型、GVHD的預防等有重要意義。

表1 909例山東漢族骨髓志愿捐獻者HLA-DRB1的等位基因頻率及血清學組特異性

山東漢族人群HLA-DRB1等位基因頻率分布與江蘇、湖南、廣東漢族、新疆維吾爾族、韓國人、日本人以及德國人相比有明顯差異，但差異程度不同，如與江蘇漢族人相比，HLA-DRB1等位基因頻率排在前3位的相同(HLA-DRB1*0901、1501、0701);而與韓國人相比，HLA-DRB1等位基因頻率排在前3位的只有1個相同(HLA-DRB1*0901)。HLADRB1具有高度多態性，不同種族、民族、地域的人有一定的相關性，但又有各自的特點。這對追溯中華民族的源和流及民族間的血緣遺傳關系具有重要意義。

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