反復自然流產患者絨毛膜組織中促血管生成素的表達變化及意義

莫發榮，滕若冰，農蔚霞，周昌文，劉良森，沈寅琛

(1廣西醫科大學，南寧530021;2廣西南寧市婦幼保健院)

促血管生成素(Ang)是由血管內皮細胞分泌的促血管生成的一組生長因子，依據其氨基酸序列的不同分為Ang-1、-2、-3、-4［1］，其主要作用是促進血管成熟和重塑。研究［2］表明，Ang-1、Ang-2對腫瘤組織的血管新生和腫瘤細胞的浸潤起促進作用，而胚胎著床過程與腫瘤細胞浸潤有相似之處，若血管新生出現障礙則導致胚胎著床失敗或出現妊娠并發癥。本研究檢測了反復自然流產(RSA)患者和健康早孕婦女絨毛膜組織組織中的Ang-1、Ang-2蛋白，觀察其表達變化并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 隨機選取37例于2010年3月～2011年7月在廣西南寧市婦幼保健院婦產科行人工流產患者(人工流產組)的絨毛膜組織，患者具備以下條件:①年齡20～38歲;②非意愿妊娠需要終止妊娠;③以往無不良妊娠史;④孕期無腹痛、陰道出血和任何不適。選擇33例同期在本院就診的發生過2次或2次以上RSA患者(RSA組)的絨毛膜組織，患者具備以下條件:①年齡20～38歲;②無染色體異常;③無子宮畸形;④無內分泌異常;⑤無血栓形成傾向;⑥流產非免疫因素、感染因素引起。兩組患者孕周＜12周，排除全身或生殖系統急性炎癥及各種良、惡性腫瘤和血管異常增生等有可能影響Ang表達的疾病。

1.1.2 試劑來源 抗Ang-1多克隆抗體(北京博奧森)，Ang-2多克隆抗體(北京博奧森)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(上海長島生物公司)，DAB顯色試劑盒和蘇木素復染液(福建邁新生物公司)，其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的檢測方法按常規石蠟切片制作方法將絨毛膜組織標本制成石蠟切片，厚度為6 μm。石蠟切片經脫蠟水化后，行免疫組化染色。切片經0.01 mol/L(pH 6.0)檸檬酸鹽緩沖液高壓修復5 min后自然冷卻。3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，免疫前血清封閉非特異性抗原?？笰ng-1多克隆抗體和抗Ang-2多克隆抗體稀釋度均為1∶400，4℃孵育過夜。按免疫組化試劑盒說明依次加HRP標記的羊抗兔IgG和底物。DAB染色、蘇木素復染、常規脫水、透明、封片。以正常非免疫兔血清取代一抗作陰性對照，以PBS取代一抗作空白對照。Ang-1、Ang-2蛋白位于絨毛膜上皮細胞中，呈棕黃色顆粒。經病理圖像分析系統(德國LEICA)在高倍鏡(×400)下拍片取圖，用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件對每張切片陽性區域進行定量檢測，測定陽性產物的積分光密度值(IOD值)。陽性反應越強，染色越深，IOD值越大。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料比較用t檢驗，相關性分析用Pearson直線相關分析法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的表達比較 人工流產組37例中有31例絨毛膜組織可見Ang-1蛋白呈陽性反應(陽性率83.8%)，有36例可見Ang-2蛋白呈陽性反應(陽性率97.3%);RSA組33例中有31例絨毛膜組織可見Ang-1蛋白呈陽性反應(陽性率93.9%)，Ang-2蛋白均呈陽性反應(陽性率100%)。所有陽性反應均見于絨毛膜上皮細胞。兩組陽性率比較，P＞0.05。兩組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的IOD值比較見表1。

表1 兩組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的IOD值比較(±s)

表1 兩組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的IOD值比較(±s)

注:與人工流產組相比，*P＜0.05

?

2.2 絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白表達與孕婦年齡的關系 RSA組絨毛膜組織Ang-1蛋白的表達隨孕婦年齡增加而上調，但無統計學意義(r= 0.326，P＞0.05);Ang-2蛋白表達隨孕婦年齡增加而下調，但也無統計學意義(r=－0.039，P＞0.05)。人工流產組絨毛膜組織Ang-1、Ang-2蛋白的表達均隨孕婦年齡增加而下調，無統計學意義(r分別為－0.079、－0.230，P均＞0.05)。

2.3 胚胎孕周與絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白表達的關系 RSA組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的表達與胚胎孕周呈正相關(r分別為0.497、0.430，P均 ＜0.05)。人工流產組絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2蛋白的表達隨胚胎孕周增加而增加，但無統計學意義(r分別為0.204、0.227，P均＞0.05)。

3 討論

RSA是一種常見病，發病率約為1%，但超過50%的RSA找不到明確的原因。目前，對RSA病因的研究還只限于細胞遺傳學、激素或代謝、子宮解剖、感染因素和自身免疫功能異常等方面，但這只是一部分。妊娠從胚泡著床到胎盤形成都離不開血液的營養供應，離不開血管新生及其通透性的改變。胎兒、胎盤及子宮蛻膜血管的生長發育是胚胎正常生長發育的關鍵，成功的妊娠要求胎盤血管網的充分發育以滿足母胎之間氣體和養料的交換及胎兒代謝廢物的排泄。胎盤的血管生成最初發生在妊娠第19天，是妊娠早期新生血管形成的主要方式，完整的胎兒毛細血管網出現在妊娠第22天前后。因此，如果胎盤血管發育不足，將影響胎兒營養的供給，胚胎難以存活，導致流產的發生［3］。

Ang的主要作用是促進血管成熟和重塑，是繼血管內皮生長因子(VEGF)之后發現的又一內皮細胞特異性的促血管生成因子［4］。Ang家族主要通過與Tie-2相互作用而參與調節血管的發生、發展等過程。Tie-2受體是特異性表達于內皮細胞和某些激酶型造血祖細胞的酪氨酸激酶型受體，在胚胎時期的血管內皮呈均勻表達［5］，Hur等［6］研究發現，Ang-1和Ang-2競爭Tie-2，Ang-1促進血管穩定而Ang-2促進血管活化并促進新生血管生成，Ang-2在與VEGF結合后通過阻斷Ang-1對血管的穩定作用而促進血管出芽。

本研究結果顯示，37例人工流產患者中31例的絨毛膜組織可見Ang-1蛋白呈陽性反應，有36例可見Ang-2蛋白呈陽性反應;33例RSA患者中有31例絨毛膜組織中可見Ang-1蛋白呈陽性反應，Ang-2蛋白均呈陽性反應。所有陽性反應均見于絨毛膜上皮細胞，而且RSA患者絨毛膜組織Ang-1蛋白和Ang-2蛋白的表達高于人工流產絨毛膜組織。提示Ang-1蛋白和Ang-2蛋白的正常表達有助于胚胎正常生長發育，過度表達則血管出現缺陷而導致胚胎死亡［7，8］。本研究結果顯示，兩組絨毛膜組織的Ang-1、Ang-2蛋白表達與孕婦年齡無關，但RSA患者絨毛膜組織的Ang-1、Ang-2蛋白表達與胚胎孕周呈正相關，隨胚胎孕周的增加而增加，這與馬華剛等［9］的研究一致。我們推測，Ang-1蛋白和Ang-2蛋白的高表達可能是造成RSA的原因之一。

［1］Valenzuela DM，Griffiths JA，Rojas J，et al.Angiopoietins 3 and 4: diverging gene counterparts in mice and humans［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(5):1904-1909.

［2］Feng Q，Liu K，Liu YX，et al.Plasminogen activators and inhibitors are transcribed during early macaque implantation［J］.Placenta，2001，22(2-3):186-199.

［3］沈寅琛.促血管生成素與血管生成及妊娠的相關性研究進展［J］.海南醫學，2010，21(15):111-113.

［4］杜彬，周序瓏.血管生成素的特點及其對血管新生的調節作用［J］.中國病理生理雜志，2003，19(2):275.

［5］Macdonald PR，Progias P，Ciani B，et al.Structure of the extracellular domain of Tie receptor tyrosine kinases and localization of the angiopoietin-binding epitope［J］.J Biol Chem，2006，281(38): 28408-28414.

［6］Hur SE，Lee JY，Moon HS，et al.Angiopoietin-1，Angiopoietin-2 and tie-2 expression in eutopic endometrium in advanced endometriosis［J］.Mol Hum Reprod，2006，12(7):421-426.

［7］Charnock-Jones DS.Soluble flt-1 and the angiopoietins in the development and regulation of placental vasculature［J］.J Anat，2002，200(6):607-615.

［8］傅曉敏，王雯，黃麗麗.藥物流產后異常子宮出血者子宮內膜中血管生成素1、2的表達［J］.解剖學報，2007，38(6):752-754.

［9］馬華剛，朱桂金.促血管生成素-1，-2基因在小鼠著床期子宮內膜的表達［J］.現代婦產科進展，2005，14(3):203-205.