左乙拉西坦對癲癇幼鼠海馬組織中多藥耐藥基因表達的影響

于 臻，孫若鵬，張冬青，李保敏

(山東大學齊魯醫院，濟南250012)

顳葉癲癇是常見的難治性癲癇之一。海人酸可誘發邊緣性驚厥和特異的海馬結構損傷，與人類顳葉癲癇急性發作的行為特點近似［1］。利用海人酸制備的自發性癲癇模型是一種接近于人類顳葉癲癇的模型。難治性癲癇的主要發病機制之一是多藥耐藥基因(mdr)在腦組織中的過度表達，導致抗癲癇藥物不能進入靶細胞發揮作用［2］。在人類基因組中，mdr分為mdr1和mdr2;在嚙齒動物mdr分為mdr1a、mdr1b和mdr2，其中人類的mdr1和嚙齒動物的mdr1a、mdr1b與多藥耐藥相關。2007年9月10日～2008年3月31日，本研究采用生后7 d的大鼠海人酸致自發性顳葉癲癇模型為研究對象，檢測大鼠海馬組織中的mdr1a、mdr1b mRNA，觀察抗癲癇新藥左乙拉西坦(LEV)及癲癇反復發作對難治性癲癇大鼠海馬組織中mdr表達的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組 選擇出生后7 d的雄性Wistar大鼠70只(山東大學動物中心提供)，隨機分為癲癇組38只和對照組32只。癲癇組給予海人酸(KA)1 mg/kg腹腔注射，急性期誘發癲癇發作后每天觀察動物有無癲癇自發性發作及死亡。對照組腹腔注射相同劑量生理鹽水。實驗鼠癲癇發作分級標準［3］:0級:無發作;1級:機械性咀嚼;2級:連續性點頭;3級:單側前肢陣攣;3.5級:雙側前肢交替陣攣;4級:雙側前肢陣攣、后退;5級:雙側前肢陣攣、后退、摔倒;6級:狂奔嘶叫;7級:強直發作。癲癇組6只因癲癇持續狀態死亡，2只在經歷4次癲癇發作后死亡，2只未有癲癇自發性發作。3周后癲癇組28只發展成自發性癲癇，每日發作5～10次。對照組均未見癲癇發作。

將癲癇組中造模成功的28只大鼠隨機分為癲癇觀察(EP)組13只及癲癇治療(EP+LEV)組15只。對照組32只大鼠隨機分為生理鹽水觀察(NS)組16只及生理鹽水治療(NS+LEV)組16只。EP +LEV組和NS+LEV組給予LEV 300 mg/kg灌胃，1次/d，共6周;EP組和NS組給予同等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，共6周。各組大鼠斷頭取海馬(處死前5 d觀察到EP+LEV組大鼠抽搐次數明顯減少)，－80℃冰箱保存備用。

1.2 海馬組織總RNA提取及mdr1a、mdr1b mRNA檢測 常規Trizol法提取大鼠海馬組織總RNA，反轉錄后行PCR。取PCR產物5 μL，加入1 μL的溴酚藍，在20 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外成像系統下觀察并攝像。以β-actin作為內參。采用Alpha Ease FC軟件分析檢測mdr1a、mdr1b及β-actin擴增產物的光密度值(OD值)。mdr1a、mdr1b mR-NA相對表達量=所測mdr1a(mdr1b)mRNA OD值/β-actin mARN OD值。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA表達比較見表1。

表1 各組海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA表達比較(±s)

表1 各組海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA表達比較(±s)

注:與NS組相比，*P＜0.01;與NS組和NS+LEV組相比，△P＜0.01;與EP組相比，#P＜0.05

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3 討論

人類顳葉癲癇的病理改變主要是海馬損傷，即海馬硬化。有相當比例的伴有海馬硬化的顳葉癲癇成人患者在兒童期存在長時間的癇性發作史。嚙齒類動物和人類一樣，其不同年齡階段的神經系統發育情況不同，生后8 d內大鼠的腦發育狀態大約相當于新生兒期。本研究選用生后7 d的大鼠，用海人酸誘導自發性顳葉癲癇，給予LEV進行干預，觀察癲癇反復發作及LEV對大鼠海馬mdr1 mRNA表達的影響。

mdr的編碼產物P-糖蛋白(P-gp)是一種具有能量依賴性“藥物泵”功能的跨膜糖蛋白。在中樞神經系統，P-gp主要存在于血腦屏障毛細血管內皮細胞和血管周圍膠質細胞，腦實質內神經元和膠質細胞也有表達，正常大鼠的mdr1a、mdr1b mRNA主要在大腦皮層、小腦、海馬、杏仁核中表達。正常情況下，P-gp主要參與細胞的物質轉運和解毒，限制外源性毒物、化學性物質等進入細胞內。Lazarowski等［4］對難治性癲癇患者手術切除的致癲灶處腦組織進行研究時發現有P-gp過度表達。

Bauer等［5］利用匹魯卡品誘導癲癇持續狀態模型，發現模型腦內毛細血管的mdr1 mRNA表達增加。這可以解釋為何先于治療開始的高頻率癇性發作可以作為預測癲癇耐藥的重要因素［6］。Sisodiya等［7］研究發現，難治性癲癇患者致癇灶腦組織中有P-gp和mdr1 mRNA過度表達，周圍正常腦組織則表達不增高，而抗癲癇藥物(AEDs)是非特異性進入腦組織，若僅是AEDs誘導mdr1 mRNA過度表達應是各處腦組織同步表達，因此認為是致癇灶神經元反復異常放電引起P-gp的表達上調。本研究發現，幼鼠在自發性癲癇發作后其海馬組織中mdr1a、mdr1b mRNA表達增多，且mdr1a mRNA表達增多更為明顯。說明難治性癲癇反復癇性發作與mdr1mRNA高表達，尤其是與mdr1a mRNA高表達有關。

有學者［8］在體外實驗中發現，抗癲癇藥物的劑量越大、用藥時間越長，大鼠腦內星形膠質細胞P-gp的表達就越高。提示藥物在誘導mdr1 mRNA的表達中起重要作用。LEV是一種新型抗癲癇藥物，對有海馬硬化的難治性癲癇患者的海馬神經元有保護作用［9］。本研究發現，LEV能有效降低癲癇大鼠癇性發作的頻率，EP+LEV組的海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA表達低于EP組;與NS組相比，NS+ LEV組海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA表達有降低的趨勢，說明 LEV對正常大鼠海馬組織 mdr1a、mdr1b的表達不僅沒有誘導作用，而且可減少癲癇大鼠海馬組織mdr1a、mdr1b mRNA的表達。

總之，本研究結果表明，反復發生的癇性發作大鼠海馬組織中mdr1 mRNA過度表達，且以mdr1a mRNA表達增多更明顯。LEV對大鼠自發性顳葉癲癇治療有效，且能降低其海馬組織mdr1 mRNA的表達。

［1］Gorter JA，Goncalves PM，Vliet EA，et al.Neuronal cell death in a rat model for temporal lobe epilepsy is induced by the initial status epilepticus and not by later repeated spontaneous seizures［J］.Epilepsia，2003，44(5):647-658.

［2］Bankstahl JP，Hoffmann K，Bethmann K，et al.Glutamate is critically involved in seizure-induced overexpression of P-glycoprotein in the brain［J］.Neuropharmacology，2008，54(6):1006-1016.

［3］Ladl FA，Sperher EF，Moshe SL.Anticonvulsant efficacy of gabapentin on kindling in the immature brain［J］.Epilepsia，2001，42 (4):458-463.

［4］Lazarowski A，Czornyj L，Lubienieki F，et al.ABC transporters during epilepsy and mechanisms underlying multidrug resistance in refractory epilepsy［J］.Epilepsia，2007，48(Suppl 5):140-149.

［5］Bauer B，Hartz AM，Pekcec A，et al.Seizure-induced up-regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier through glutamate and cyclooxygenase-2 signaling［J］.Mol Pharmacol，2008，73(5): 1444-1453.

［6］Regesta G，Tanganelli P.Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies［J］.Epilepsy Res，1999，34(2-3):109-122.

［7］Sisodiya SM，Lin WR，Harding BN，et al.Drug resistance in epilepsy:expression of drug resistance proteins in common causes of refractory epilepsy［J］.Brain，2002，125(1):22-31.

［8］Lü Y，Yan Y，Wang XF.Antiepileptic drug-induced multidrug resistance P-glycoprotein overexpression in astrocytes cultured from rat brains［J］.Chin Med J(Engl)，2004，117(11):1682-1686.

［9］Mula M，Sander JW，Trimble MR.The role of hippocampal sclerosis in antiepileptic drug-related depression in patients with epilepsy: a study on levetiracetam［J］.Seizure，2006，15(6):405-408.