穩(wěn)心顆粒對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2增殖及其Cx43 mRNA表達(dá)的影響

楊 軍，鄧 彪，丁賽良，王光輝，張 勇，王蘇燕，鄺 孛，文格波

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421001)

心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括損傷因素或負(fù)荷增加所產(chǎn)生的心肌組織、結(jié)構(gòu)和功能等一系列變化，如心肌細(xì)胞活性降低、心肌細(xì)胞肥大、凋亡基因和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞胞外成分的改變。抑制心室重構(gòu)不僅是當(dāng)前治療充血性心力衰竭的一個(gè)主要方向和目標(biāo)［1］，同時(shí)也是改善心力衰竭預(yù)后和減少惡性心律失常導(dǎo)致心源性猝死的重要干預(yù)靶點(diǎn)。去甲腎上腺素(NE)作為加速心室重構(gòu)的主要交感神經(jīng)遞質(zhì)，其對(duì)心臟的長(zhǎng)期作用已被證明是導(dǎo)致心力衰竭和心源性猝死的重要機(jī)制之一［2］。心肌細(xì)胞間的縫隙連接(GJ)與細(xì)胞代謝分化、物質(zhì)運(yùn)輸和電興奮傳導(dǎo)有密切關(guān)系［3］，而心肌重構(gòu)和電生理失穩(wěn)態(tài)與心肌細(xì)胞間GJ的改變密切相關(guān)，其中主要表達(dá)在心室肌中的縫隙連接蛋白Cx43已經(jīng)成為當(dāng)前治療心律失常的新靶點(diǎn)［4］。穩(wěn)心顆粒(WXKL)由黨參、黃精、三七、琥珀、甘松組成，具有寧心復(fù)脈、益氣養(yǎng)陰、定悸安神、活血化瘀功效，兼有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ類(lèi)抗心律失常藥物的作用［5］。但WXKL對(duì)心肌細(xì)胞肥大及縫隙連接蛋白Cx43的影響尚不明確。2011年6月1日～2012年3月1日，我們觀察了WXKL對(duì)NE誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的增殖及縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響，初步探討WXKL治療心律失常和改善心肌電生理重構(gòu)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 WXKL(步長(zhǎng)制藥公司);高糖液體培養(yǎng)基;胎牛血清(四季青公司);胰酶細(xì)胞消化液(碧云天公司);Trizol RNA提取液(invitrogen，美國(guó));RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas，美國(guó));PCR引物(北京賽百特公司合成);PCR試劑(天根生化公司);其余常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;PCR儀(Biometra，，德國(guó))，冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó));酶標(biāo)儀(ELX-808，美國(guó));電泳儀(DYY-7C，北京六一儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(AlphamagerTM3400，美國(guó));倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H9C2細(xì)胞來(lái)源于大鼠胚胎期心臟組織(由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所提供)，在37℃、5%CO2條件下，于含10%胎牛血清的高糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞90%匯合后用于實(shí)驗(yàn)。胰酶消化液消化細(xì)胞后種入培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為4組:對(duì)照組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng);NE組用加入NE(終濃度為1×10－5mol/L)的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng);WXKL組用加入WXKL(終濃度為1 ×5 mg/mL)的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng);NE+WXKL組用加入NE(濃度同上)和WXKL(濃度同上)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞直徑及蛋白測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞以1×105/mL種植于6孔板，按以上分組進(jìn)行相應(yīng)處理，72 h后用胰蛋白酶消化使之脫落，在相差顯微鏡下用測(cè)微器測(cè)定細(xì)胞直徑，觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)10個(gè)細(xì)胞，取平均值(每組取5次樣本進(jìn)行分析)。培養(yǎng)的細(xì)胞用冷PBS沖洗2次，晾干。每孔加200 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min。將裂解的細(xì)胞移至0.5 mL離心管并搖動(dòng)，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，按照BCA試劑盒說(shuō)明在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度(每組取5次樣本進(jìn)行分析)。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定 采用MTT法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔板中，每組5個(gè)孔(設(shè)實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，按以上實(shí)驗(yàn)分組分別加入各組對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基100 μL進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，加入10 μL的MTT溶液5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值× 100%。

1.5 細(xì)胞Cx43 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞以1×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞均勻貼壁后按以上實(shí)驗(yàn)分組，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基2 mL進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后提取RNA，按照f(shuō)ermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.參照Genebank資料設(shè)計(jì)并合成引物;內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段400 bp;Cx43擴(kuò)增片段588 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃2 min后，94℃ 30 s、55℃30 s、72℃45 s，順序循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取適量PCR產(chǎn)物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，根據(jù)各DNA條帶的綜合光密度值(IDV值)進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0及EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2細(xì)胞直徑、蛋白濃度和細(xì)胞活力比較 各組H9C2細(xì)胞直徑、蛋白含量及OD值、細(xì)胞增殖率見(jiàn)表1。表1顯示，WXKL能夠明顯抑制NE誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞直徑的增大、蛋白含量的增加，能夠明顯增強(qiáng)NE誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞的活力。

2.2 各組H9C2細(xì)胞Cx43 mRNA的表達(dá)比較 各組細(xì)胞Cx43、β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳帶位置與理論位置相符。對(duì)照組IDV值為89%±3.35%、NE組為59%±2.55%、WXKL組為88%±3.93%、NE+WXKL組為72%±3.12%，WXKL組與對(duì)照組相比，P＜0.05;NE+WXKL組與NE組相比，P＜0.05。表明WXKL能明顯抑制NE誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞Cx43 mRNA的表達(dá)下降。

表1 各組H9C2細(xì)胞直徑、蛋白濃度及OD值、細(xì)胞增殖率比較(±s)

表1 各組H9C2細(xì)胞直徑、蛋白濃度及OD值、細(xì)胞增殖率比較(±s)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05;與NE組相比，#P＜0.05

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3 討論

NE作為主要的交感神經(jīng)遞質(zhì)之一，在心衰早期活性增強(qiáng)有助于改善心血管功能，但長(zhǎng)期持續(xù)增強(qiáng)就會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用并導(dǎo)致病理性心室重構(gòu)，主要包括:心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的損失和破壞，心肌細(xì)胞外基質(zhì)成分改變。心室重構(gòu)后會(huì)導(dǎo)致心臟功能下降和心律失常的發(fā)生。因此，預(yù)防心室重構(gòu)是治療心力衰竭和心律失常的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［6，7］。Cx43作為心肌細(xì)胞間隙的主要連接蛋白，在維持心肌細(xì)胞的通訊功能及電生理信號(hào)的傳遞中起著重要作用，它在心肌細(xì)胞中表達(dá)減少、結(jié)構(gòu)異常、分布改變均可以引起心律失常［8］。

臨床上已證明WXKL對(duì)心力衰竭、心律失常、病毒性心肌炎、擴(kuò)張性心肌病及急性冠脈綜合征等多種心血管疾病具有良好的治療效果［9］，其中以對(duì)心律失常的療效最為顯著。WXKL對(duì)多種離子通道有抑制作用，可以降低QT離散度，改善心率變異性，使心肌細(xì)胞電極均勻一致，可以通過(guò)減輕缺血缺氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的損傷而對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)起到保護(hù)和修復(fù)作用［10］。但WXKL修復(fù)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的同時(shí)，是否能改善心肌細(xì)胞功能、抑制心肌細(xì)胞肥大及增加其Cx43的表達(dá)，目前未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

本研究通過(guò)使用低濃度的(1×10－5mol/L)NE誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞肥大，在體外模擬心室重構(gòu)，發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞的活力較對(duì)照組明顯下降，可能與NE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大有關(guān)。朱艷霞等［2］也發(fā)現(xiàn)，10 μmol的NE可以促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，在一定程度上促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，WXKL可以明顯抑制NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，改善心肌細(xì)胞活力，這可能與其減少了NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［11］。同時(shí)，NE組H9C2細(xì)胞的Cx43 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降。表明WXKL可逆轉(zhuǎn)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Cx43 mRNA的表達(dá)下降。

NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和Cx43 mRNA表達(dá)的下調(diào)，可能是心室重構(gòu)后更易發(fā)生心律失常的機(jī)制，而WXKL改善心肌細(xì)胞肥大并增加其CX43的表達(dá)可能是其治療心律失常的機(jī)制之一。

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