低濃度混合酶改良消化法體外培養SD大鼠面頜肌細胞

殷忠平，許艷華，徐 蕓，果 利

(1大慶龍南醫院，黑龍江大慶163453;2昆明醫學院附屬口腔醫院)

頜面部肌肉的調控和改建在牙頜面畸形矯治及療效保持過程中起著關鍵作用。功能矯治器通過改變頜面部肌肉功能調節和刺激顱面骨骼生長而促進頜的發育，建立新的神經肌肉動力平衡協調關系，使口頜系統正常生長發育，從而矯正形成中的牙頜面畸形。原代培養骨骼肌細胞的報道較多［1～3］，但對面頜肌細胞原代培養報道較少。在借鑒及摸索實踐的基礎上，本研究用低濃度混合酶改良消化法成功地進行了SD大鼠頜面肌細胞的體外培養，觀察了該細胞在體外生長的一般生物學特性和生長規律，為頜面部肌肉組織功能改建的生物學和生物力學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 出生2～3 d的SD大鼠(昆明醫學院動物科提供)。胎牛血清(FBS:Gibco公司)，DMEM培養基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠面頜肌細胞的原代培養及純化 ①SD大鼠乙醚麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min，解剖分離頜面部咬肌區肌肉組織。用含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的冷PBS液沖洗4～6遍，去除脂肪及粘連的軟骨組織，無菌濾紙拭干，用眼科剪將其剪成約1 mm3的碎塊，冷PBS液洗滌3次，組織漿移入25 mL培養瓶。②先加入0.1%的Ⅰ型膠原酶，消化10 min，棄上清液;再加入混合酶(0.1%的Ⅰ型膠原酶:0.125%的胰酶=1∶1)37℃振蕩消化20 min。待大組織沉淀后，取上清液，加入含10% FBS的DMEM培養基終止消化，過濾。將剩余大組織移入消化培養瓶，按上述步驟重復2～3次。③濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀物用含20%FBS的DMEM增殖培養基重懸。細胞懸液移入培養瓶，37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置30 min，將上清細胞懸液如此純化細胞4次。④ 將純化后的面頜肌成肌細胞以1×106/mL接種于25 mL培養瓶中，加增殖培養基，37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中原代培養。

1.2.2 SD大鼠面頜肌細胞的傳代培養 當原代培養的SD大鼠面頜肌細胞生長至鋪滿培養瓶80%以上時，倒掉培養基，加入0.125%的胰蛋白酶消化2～3 min，并不斷用吸管吹打。用含10%FBS的DMEM生長培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，生長培養基重懸沉淀細胞，以1× 105/mL接種于25 mL培養瓶中。首次傳代后的細胞長滿瓶底70%～80%后按1∶2或1∶3傳代。

1.2.3 SD大鼠面頜肌細胞的形態學觀察及生物學鑒定 ①倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，記錄細胞貼壁、分化、融合及肌管形成情況并照相。取第1代培養的SD大鼠面頜肌細胞蓋玻片爬片，用SP法進行結蛋白(Desmin)免疫組化染色，用成纖維細胞作對照。

1.2.4 SD大鼠面頜肌細胞生長曲線繪制及細胞倍增時間計算 ①取第3代SD大鼠面頜肌細胞，以1.25×104/mL接種至24孔培養板，每天選3孔細胞用4%苔盼藍染色，計數活細胞，每孔計數3次，取平均值，共計數7 d。根據細胞計數結果和時間繪制生長曲線。②計算細胞倍增時間:T=t×log2/ (logNt－logN0)，T為SD大鼠面頜肌細胞數增加1倍的時間，N0為第1天細胞數，Nt為生長高峰期(第5天)細胞數，t為倍增時間(120 h)。

2 結果

倒置顯微鏡下觀察發現，體外培養的SD大鼠面頜肌細胞經酶消化后呈球形，接種12 h后細胞開始貼壁，單個，呈圓形或梭形。24 h后細胞完全貼壁開始增生，呈梭形，有兩極，體積小，折光性強;少量細胞多角形，有突起。第2～3天，細胞具有較強的分裂增殖能力，單核雙極大量伸展，并逐漸變成紡錘形，胞質豐富，胞核位于細胞中央，呈橢圓形，核仁明顯。第4天肌細胞大量增殖，變得細長，呈長軸平行排列，具有方向性，細胞之間出現融合現象，形成多核性長管狀初生肌管，肌管多數平行排列。第5～6天肌管數量增多，體積增大，細胞核數目明顯增多。第7～8天細胞融合形成肌管達高峰，呈典型的“峰～谷”樣生長。免疫組化染色后顯微鏡下觀察，見肌細胞呈梭形，胞核較大，細胞質Desmin染色陽性(陽性率達95%以上，胞核無染色)，而成纖維細胞無Desmin表達。證明培養、分化的細胞為SD大鼠面頜肌細胞。

SD大鼠面頜肌細胞接種后經過1 d的潛伏適應期，第2天細胞進入指數生長期，持續3～4 d;第5天細胞進入平臺生長期，第6天細胞達到增殖高峰。體外培養2～6 d，細胞生長活躍之后增殖速度減慢，數目逐漸減少。SD大鼠面頜肌細胞生長曲線見圖1。SD大鼠面頜肌細胞T平均為37.76 h。

圖1 SD大鼠面頜肌細胞生長曲線

3 討論

胰蛋白酶和膠原酶是酶消化法細胞培養的常用酶。胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織，而膠原酶則對細胞間質有消化作用［4］。因成肌細胞位于肌纖維和基底膜之間，單純用膠原酶只能使肌纖維相互分離，只有胰蛋白酶才能分離成肌細胞，且新生大鼠骨骼肌組織以Ⅰ型膠原為主［5］。本實驗將酶消化步驟略作改進，將其分兩步進行:先用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化分離出肌纖維，10 min后去上清液使易被膠原酶解離出來的內皮細胞、成纖維細胞等混雜細胞先游離出來而被去除，得到純凈的肌纖維;再用0.1%的Ⅰ型膠原酶和0.125%的胰蛋白酶(1∶1)聯合消化20 min后收集細胞。結果表明，低濃度的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合消化，減少了酶對細胞的損傷，細胞培養周期短且細胞純度高、產量高、活性強、穩定性好。此法既節約了酶的用量，又提高了細胞成活率，更好地保護了離體面頜肌細胞的性狀和生長代謝，有利于對該細胞進行體外研究。

由于成纖維細胞、血管內皮細胞30 min左右即可完全貼壁，比肌細胞貼壁迅速，而此時肌細胞因Ca2+作用呈聚集懸浮狀態，故本實驗利用差速貼壁法對細胞進行純化［6］。每次換瓶前均反復多次輕輕吹打，使細胞成單個分散狀態，以獲得更高純度的面頜肌細胞。

可通過骨骼肌成肌細胞在體外能夠分化成肌小管、形成橫紋，甚至可見收縮這些特異性形態學變化對其進行鑒定。本實驗體外培養的成肌細胞，當降低血清濃度或細胞密集時，清晰可見成肌細胞在長軸方向相互融合，形成多核肌管，未見橫紋及成肌細胞收縮。免疫組織化學方法鑒定成肌細胞包括肌球蛋白(Myosin)、Desmin、M-鈣黏蛋白(M-cadherin)及α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcometric actin)［7，8］的檢測。Desmin具有高度組織特異性［9］，是肌細胞的骨架蛋白和功能蛋白，在成肌細胞分化的早期即能檢測到，是哺乳動物成肌細胞的早期標志［10］，也是鑒定成肌細胞的有效方法。

本實驗先用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化解離出肌纖維，再用低濃度的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合酶消化，差速貼壁法純化細胞的方法步驟簡單，所需時間短。為從細胞生物學角度研究外因作用下頜面部肌肉組織適應性功能改建機制提供了細胞體外培養的模型。

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