Ad-hTIMP1感染對Hcy刺激人臍靜脈內皮細胞MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA表達的影響

李 匯，毛用敏，趙莉莉，崔讓莊，王佩顯

(1天津醫科大學總醫院，天津300052;2天津市胸科醫院)

金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是基質金屬蛋白酶(MMPs)的內源性特異性抑制劑，MMPs是降解細胞外基質(ECM)成分的主要酶系［1］。近年研究［2］發現，動脈粥樣硬化(AS)的病理過程與MMPs/TIMPs的失衡密切相關，而高水平同型半胱氨酸(Hcy)可以通過影響血管內皮細胞MMPs的表達，促進ECM的降解，進而降低AS斑塊的穩定性［3］。本研究利用腺病毒載體系統AdEasy System構建攜帶人 TIMP1基因片段的重組腺病毒Ad-TIMP1，用其感染體外培養的人臍靜脈內皮細胞CRL-1730，觀察該細胞MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA的表達變化，探討TIMP1基因轉導對Hcy造成的內皮細胞損傷的保護作用，為基因治療AS、穩定AS斑塊提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 AdEasy復制缺陷型腺病毒載體系統(穿梭質粒pAd-Track-CMV和骨架質粒pAdEasy-1)以及包裝細胞系人胚腎細胞(293T)購自北京大學實驗室;pUCm-T載體質粒及BJ5183菌株、JM109菌株、DH5α菌株均為本實驗室保存;TaqDNA聚合酶為本實驗室提取保存，限制性內切酶BgⅢ、NotⅠ和DNA marker購自TakaRa生物工程(大連)有限公司，Pac I購自NEB公司;T4 DNA連接酶、高純度質粒柱式提取試劑盒和脂質體購自INVITROGEN公司，胎牛血清(FBS)和DMEM高糖培養液購自美國GIBCO公司。

1.2.1 pUC-hTIMP1重組質粒的構建 在Genebank中搜索hTIMP1序列，設計上游引物為5'-AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT-3'，下游引物為5'-GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG-3'。從人心肌組織中提取總 RNA，采用 RT-PCR技術得到人 TIMP1 (hTIMP1)的基因片段，將其連接到pUCm-T載體質粒中，轉化入感受態JM109細胞，含氨芐青霉素的LB培養基篩選陽性克隆，提取質粒，NcoI酶切鑒定正確后再次轉化入JM109進行擴增，測序正確后提取質粒。

1.2.2 穿梭質粒AdTrack-CMV-hTIMP1的構建分別用BgⅢ和NotⅠ雙酶切pUC-hTIMP1和穿梭質粒pAdTrack-CMV，用凝膠回收hTIMP1片段和開環質粒pAdTrack-CMV，T4 DNA連接酶連接二者并轉化JM109感受態細胞，含卡那霉素的LB培養基篩選陽性克隆，提取質粒，酶切及測序鑒定正確后再次轉化JM109感受態細胞擴增，提取質粒，命名為重組質粒AdTrack-CMV-hTIMP1。 1.2.3 細菌內同源重組產生重組腺病毒質粒AdEasy-GFP-hTIMP1 電穿孔法(2 500 V，5 ms)將PemI酶切線性化的1 μg的AdTrack-CMV-hTIMP1重組質粒和1 μg的pAdTrack-CMV(空載體陰性對照)分別轉化到含有pAdEasy-1的電感受態大腸桿菌BJ5183中，通過卡那霉素LB培養基平板篩選(50 μg/mL)獲得陽性腺病毒重組質粒，BamHⅠ和PacⅠ酶切鑒定，PCR進一步鑒定。選取重組正確的質粒(Ad-hTIMP1和Ad-Track)在DH5α菌中擴增，高純度質粒柱式提取試劑盒提取質粒，Pac I酶切線性化后凝膠回收較大片段，冰乙醇沉淀，溶于無菌水中待用。

1.3 重組腺病毒在293T細胞中的包裝和擴增

1.3.1 重組腺病毒質粒轉染293T細胞并包裝 采用陽離子脂質體法。用脂質體Lipofectamine 2000及Plus reagent將4μg的 pAd-hTIMP1和4μg的pAd-Track轉染到2個60 mm培養皿中(細胞融合度為50%～60%)進行病毒包裝，24 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達，倒置相差顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)。于轉染后第9天收集細胞，反復凍融法得到重組腺病毒Ad-hTIMP1和Ad-Track上清。

1.3.2 包裝好的重組腺病毒感染293T細胞并擴增

取病毒上清的1/3感染293T細胞(約90%融合)，感染后第3天反復凍融法收集重組腺病毒上清，反復感染4次于293T細胞中擴增病毒到所需滴度。

1.3.3 重組腺病毒的純化 用CsCl密度梯度離心法純化重組腺病毒顆粒，用OD260法測定腺病毒的滴度。根據公式(病毒滴度=OD260×病毒稀釋度×測定稀釋度×1.1×1012)進行計算。用2%、pH 6.2的磷鎢酸溶液對樣品進行負染，透射電鏡下觀察。

1.4 腺病毒介導hTIMP1在內皮細胞中過表達對抗Hcy對內皮細胞刺激的觀察

在開始實際的Milk-run設計之前，必須對實施Milk-run的條件進行調整，以確定是否滿足了允許在工廠內使用Milk-run生產系統的3個要求：布局、安全和物料。

1.4.1 腺病毒感染細胞 將CRL-1730細胞分到6孔板中(2.4×105/孔)。24 h后，按6個感染復數(MOI)值(30，50，70，90，110，150)進行腺病毒感染，48 h后觀察細胞及其熒光表達情況。

1.4.2 細胞分組及處理 根據加入重組腺病毒的不同將CRL-1730細胞分為三組，即空白對照組、Track對照組和基因治療組。根據以上各組中加入Hcy的劑量不同各分成三個亞組:Hcy 0 mmol/L(空白對照)組，Hcy 0.01 mmol/L(生理濃度)組和Hcy 0.1 mmol/L(病理濃度)組。每個亞組均設8個復孔，Hcy刺激后6 h收集各復孔中的細胞培養液。

1.4.3 CRL-1730細胞MMP1、MMP9及TIMP1基因片段的擴增 采用RT-PCR法，以GAPDH為內參照。用UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒(上海生工)提取各組CRL-1730細胞中的總RNA，逆轉錄得到cDNA，PCR擴增MMP1、MMP9及TIMP1基因片段(PCR引物設計及實驗條件見表1)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。以電泳條帶的灰度代表mRNA含量，目的基因與內參電泳條帶的灰度比值反應目的基因的相對值。Gel-pro 3.1凝膠成像系統分析結果。

表1 PCR引物序列及實驗條件

1.5 統計學方法 以每亞組的8個樣品值中目的基因的mRNA相對值計算均數，數值以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間比較采用LSD檢驗或Dunnett's t檢驗(方差不齊時)。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞中hTIMP1的擴增結果 擴增后得到637 bp的hTIMP1特異條帶。

2.2 AdEasy-GFP-hTIMP1重組質粒PacⅠ酶切鑒定結果 在pAd-Track-CMV上有兩個PacⅠ的酶切位點，可將重組子切為一個大片段和一個約4.5 kb的小片段，見圖1。

圖1 PacⅠ酶切Ad-hTIMP1和Ad-Track重組質粒

2.3 293T細胞中包裝并擴增腺病毒結果 重組腺病毒轉染293T細胞后，第4～5天熒光顯微鏡下可觀察到GFP呈“彗星狀”改變。轉染第9天采用反復凍融法收集病毒液，并將之感染293T細胞，第3天可以觀察到典型的CPE。反復感染、凍融收集3次后，CsCl密度梯度離心法純化，OD260法測得重組腺病毒pAd-hTIMP1的滴度為1.9×1012VP/mL，對照重組腺病毒pAd-Track的滴度為0.6×1012VP/ mL。透射電鏡下見病毒顆粒直徑約90 nm，呈多面體形狀，絕大多數病毒顆粒完整。

2.4 腺病毒裂解液hTIMP1的PCR擴增結果 擴增產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳可見 637 bp的hTIMP1特異條帶(圖2)。

圖2 腺病毒裂解液hTIMP1的PCR擴增片段(可見637 bp的特異條帶)

2.5 重組腺病毒感染CRL-1730細胞后倒置熒光顯微鏡下的觀察結果 重組腺病毒感染CRL-1730細胞后，倒置熒光顯微鏡下可見熒光表達強烈，且多數細胞均有熒光表達。

2.6 各組CRL-1730細胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表達比較 見表2。表2表明，病理劑量Hcy可以刺激CRL-1730細胞的MMP1、MMP9 mRNA表達升高;重組Ad-hTIMP1感染CRL-1730細胞后其hTIMP1 mRNA的高表達可抑制MMP1 mRNA的表達，并可對抗Hcy對CRL-1730細胞的損傷作用; hTIMP1 mRNA過表達對MMP 9的轉錄有一定的抑制作用。

3 討論

AS斑塊局部ECM降解增加而合成減少等因素增加了斑塊的易損性，從而誘發急性冠脈綜合征的發生。因此，如何降低AS斑塊的易損性，防止AS斑塊的破裂是當前AS防治研究的新方向。

表2 各組CRL-1730細胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表達比較(±s)

表2 各組CRL-1730細胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表達比較(±s)

注:與空白對照組相比，*P＜0.05;與0 mmol/L濃度組相比，△P＜0.05

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研究表明，AS斑塊損傷部位MMPs表達升高，包括間質膠原酶(即MMP1)、明膠酶(即MMP2和MMP9)以及基質降解酶(即MMP3)，而TIMP1和TIMP2等表達減少。Johoson等［4］在冠狀動脈的AS斑塊中檢測發現MMPs與TIMPs的比例失調，認為調節兩者之間的比例可起到治療AS的作用。Rouis等［5］報道，腺病毒介導 TIMP1過表達可以減輕ApoE-/-小鼠的頸動脈AS損傷程度，并推測此作用是由于TIMP1抑制MMPs活性，保護了ECM，進而抑制了平滑肌細胞的移行所致。該研究中，小鼠喂食6周高膽固醇食物后注射攜帶TIMP1的重組腺病毒，4周后AS斑塊的損傷面積明顯減小，與之前研究轉基因過表達TIMP1抑制MMPs表達的結果相一致［6］。另外，感染攜帶TIMP1的重組腺病毒(Ad.TIMP1)使豬主動脈內皮細胞過表達TIMP1，可以減少細胞移行及對ECM的侵襲［7］。利用分子生物學技術使局部TIMPs過表達，為治療AS帶來了希望［8］。

已知遺傳性高Hcy血癥與早發AS有關，其機制可能與Hcy損傷血管內皮細胞，誘使平滑肌細胞肥大、增生及移行，促進ECM特別是膠原的降解等作用有關。研究［9］表明，高Hcy血癥患者外周血單核細胞中MMP9 mRNA水平升高，表明Hcy可以通過調節MMPs的活性而導致AS。有報道ApoE缺失的小鼠高Hcy血癥可增加AS面積，升高MMP9的表達，表明Hcy可以改變血管壁ECM的穩態。而腺病毒介導局部過表達TIMP1對不同濃度Hcy刺激的內皮細胞是否有保護作用目前未見報道。

本研究發現，病理濃度Hcy可以刺激人臍靜脈內皮細胞中MMP1、MMP9 mRNA的表達增加，使MMPs/TIMP1升高，二者比例失衡。表明Hcy可以通過影響MMPs的表達，增加ECM的降解，這與之前的研究是一致的［10］。另外，重組Ad-hTIMP1感染內皮細胞后細胞內TIMP1 mRNA表達明顯升高，即使在病理劑量Hcy刺激下，TIMP1 mRNA的表達仍處于高水平，說明外源性TIMP1可對抗Hcy的抑制作用。病理濃度Hcy可刺激CRL-1730細胞MMP1、MMP9 mRNA的表達增加。感染了 Ad-TIMP1的CRL-1730細胞在受到病理濃度Hcy刺激時MMP1、 MMP9 mRNA表達均減低，說明TIMP1 mRNA過表達對MMPs的表達有一定的抑制作用，從而對抗Hcy對內皮細胞的損傷作用，這為TIMP1作為靶基因用于穩定動脈粥樣斑塊的基因治療奠定了基礎。

目前，TIMP1的作用機理尚不完全清楚，有人推測可能通過其第17～19位上的亮氨酸—頡氨酸—異亮氨酸與MMP1的S1'-S2'-S3'區結合，使MMP1第16位上天冬氨酸殘基的羧基作用于其活性中心的鋅，從而抑制其活性。本研究發現，TIMP1mRNA過表達降低了MMP1、MMP9 mRNA水平。表明TIMPs過表達可能對MMPs的轉錄有抑制作用，但其機理尚需進一步研究。

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