小肝癌患者外周免疫狀態變化及手術、射頻消融治療的影響

朱玲燕，龐雄昊，周 嘉

(1中山大學生命科學學院，廣州510275;2中山大學腫瘤防治中心; 3南方醫科大學免疫學教研室)

腫瘤發生后，機體固有的免疫細胞和適應性免疫細胞可以通過不同的方式識別腫瘤細胞，激發免疫效應機制，發揮抗腫瘤作用，而腫瘤則可以通過多種途徑逃逸機體的免疫監視［1］。癌癥患者機體免疫狀態發生變化，局部免疫細胞如調節性T細胞(Treg細胞)［2］、NK細胞［3］的浸潤分布甚至與患者預后相關。手術切除是原發性肝細胞肝癌(HCC)的首選治療方法之一，射頻消融逐漸成為其重要的治療方式［4］。有報道［5］HCC患者外周免疫細胞群體比例發生變化，但各類細胞及其亞群的比例以及它們的功能分子表達是否同時發生改變則尚未明確，上述兩種治療方法對HCC的患者外周固有免疫和適應性免疫的影響也少有報道。為此，我們以小肝癌患者為研究對象，通過流式細胞術方法，檢測了解其外周T細胞、NK細胞及其亞群在數量(群體比例)和質量(功能分子)方面的改變，并探討手術切除和射頻消融對小肝癌患者免疫狀態的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2007年10月～2008年4月于中山大學腫瘤防治中心接受手術切除或射頻消融治療的、腫瘤直徑≤6 cm的HCC(小肝癌)患者各13例(共26例)，男25例，女1例;年齡38～75歲;均有乙型肝炎病史，血清AFP陽性(≥25 ng/mL)12例; TNM分期Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期2例。手術切除治療者經病理學檢查確診;射頻消融治療者符合歐洲肝病研究學會(EASL)標準［6］，經超聲、CT或超聲引導下獲取活組織做病理檢查確診。所有患者術前未接受其他任何治療，無自身免疫性疾病史及免疫治療史。術前及術后1個月抽取其外周血進行流式細胞術檢測。另設與小肝癌患者年齡、性別相近的健康人17例(均為男性，年齡平均46歲)作對照;經檢測均無HCV、HBV、HIV和梅毒感染。

1.2 外周血NK細胞亞群、T淋巴細胞亞群及其CD25、perforin分子檢測 采用流式細胞術。本實驗涉及的抗體和化學試劑如下:熒光標記的 CD3、CD4、CD8、CD56、CD25抗體及perforin抗體;固定破膜試劑盒;淋巴細胞分離液。分別取健康人及小肝癌

患者的外周抗凝血3 mL，加至淋巴細胞分離液上面，密度梯度離心后取中間層細胞，即為外周血單個核細胞(PBMC)。取PBMC，按1×106/100 μL重懸至FACS管內，加入流式抗體后混勻，4℃染色孵育30 min，洗滌離心去除多余抗體。需同時標記perforin的樣品則隨后按固定破膜試劑盒進行胞內抗體染色。最后 FACS Vantage SE機器上樣檢測，Flowjo軟件分析。流式細胞檢測分析根據FSC/SSC點圖，設定淋巴細胞門后讀取/Lym(即NK細胞)、NK 細胞)(即輔助性T細胞:Th細胞)(即細胞毒性T細胞:Tc細胞)的比例;分析Th細胞)(即perforin+T細胞)、perforin+/(即perforin+NK細胞)比例。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據比較用非參數檢驗方法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小肝癌患者及健康人外周NK細胞、T淋巴細胞亞群變化 小肝癌患者切除術前及射頻術前NK細胞比例低于健康人(P均＜0.05)，低殺傷功能的NK細胞比例高于健康人(P均＜0.05)。手術切除1個月后，小肝癌患者NK細胞比例較術前升高(P＜0.05)，細胞比例有降低趨勢(13例中有8例降低);射頻消融1個月后，小肝癌患者NK細胞比例有升高趨勢(13例中有8例升高)細胞比例較術前降低(P＜0.01)。小肝癌患者切除術、射頻術前T細胞比例高于健康人(P＜0.01);手術切除或射頻消融術后1個月，T細胞比例呈降低趨勢(分別有8例和7例降低)，但與術前相近(P均＞0.05)。詳見表1。

2.2 小肝癌患者及健康人外周淋巴細胞CD25、perforin表達變化 小肝癌患者切除術、射頻術前Th細胞比例高于健康人(P均＜0.01)，手術切除或射頻消融術后下降(P均＜0.05)，但仍高于健康人(P均＜0.01)。小肝癌患者perforin+NK細胞及perforin+T細胞的比例與健康人相近(P均 ＞0.05)，手術切除或射頻消融術后也沒有發生明顯變化(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 小肝癌患者與健康人外周血NK細胞、T淋巴細胞亞群(%，±s)

表1 小肝癌患者與健康人外周血NK細胞、T淋巴細胞亞群(%，±s)

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3 討論

本研究結果表明，與健康人相比，小肝癌患者外周NK細胞比例降低，低殺傷功能的NK 細胞比例則升高;手術切除腫瘤后前者增加，后者呈降低趨勢;而經射頻消融后前者呈增加趨勢，后者顯著減少。小肝癌患者Th細胞比例高于健康人，手術切除或射頻消融后降低;小肝癌患者T細胞比例增加，而Th、Tc細胞群體及perforin+NK細胞或perforin+T細胞的比例無明顯變化，手術切除或射頻消融對它們也沒有顯著影響。由此可見，小肝癌患者外周固有免疫細胞及細胞免疫細胞比例發生明顯改變，手術切除或射頻消融后一定程度上得以恢復。

NK細胞具有強大的天然殺傷能力，在宿主抗癌機制中發揮重要作用，而細胞亞群則是高分泌細胞因子、低細胞毒殺傷的群體［7］。本研究發現，小肝癌患者NK細胞及NK細胞亞群的比例有明顯變化，而perforin+NK細胞比例變化不大。提示荷瘤機體從兩個側面從數量方面影響NK細胞的抗腫瘤作用，而非NK細胞自身的殺傷潛能低下。這與我們之前的研究結果一致［3］。對于小肝癌患者，通常首選的治療方法是手術切除，而射頻消融是近年來被認為有良好療效的治療方法［8，9］。我們觀察到，手術切除和射頻消融對perforin+NK細胞的比例沒有影響，能增加NK細胞的比例并減少K細胞比例。表明兩種治療方法都能在清除腫瘤后有效恢復機體的抗腫瘤固有免疫。然而，手術切除能更顯著增加NK細胞的比例，射頻消融則更顯著減少細胞亞群的比例。提示兩種治療方法在恢復機體固有免疫方面有不同的優勢。這可為小肝癌患者的進一步免疫治療提供參考。

Th細胞主要通過活化后分泌多種細胞因子參與/調節抗腫瘤免疫［10］。CD25是IL-2受體的α鏈，表達于活化的T、B細胞等。本研究發現，小肝癌患者Th細胞比例高于健康人，手術切除或射頻消融后下降。細胞中含有 Treg細胞［11］。研究［2］表明，Treg細胞在HCC免疫逃逸機制中發揮重要的作用，手術切除或射頻消融治療后Treg細胞水平的降低，提示這兩種方法均可抑制Treg細胞介導的免疫逃逸。同時，細胞中也含有大量活化的Th細胞，本結果也提示小肝癌患者外周Th細胞活化程度偏高，經治療后得以部分恢復。其中一個可能的原因是，機體由于存在腫瘤及相關的炎癥，體內細胞免疫狀態被激活，腫瘤被消除后，相應的細胞活化程度削弱。這也從另一個側面說明手術切除與射頻消融除了能清除機體內的腫瘤外，對恢復小肝癌患者細胞免疫狀態也起著一定的作用。本研究還發現，經手術切除或射頻消融后小肝癌患者Th細胞比例仍然高于健康人。腫瘤消除后機體仍存在較高水平的Treg細胞及免疫活化這一現象需進一步探討，以便為患者的免疫治療提供參考。

綜上所述，與健康人相比，小肝癌患者外周NK細胞比例下降，其NK細胞的比例則上升，Th細胞比例也升高;手術切除或射頻消融后上述變化明顯恢復。提示小肝癌患者外周固有免疫及細胞免疫狀態發生改變，手術切除或射頻消融后獲得一定改善。本研究還發現，兩種治療方法在恢復不同細胞的比例上各占優勢，且未能恢復CD25的表達至健康人水平，它們之間的差異及消除腫瘤后的機體免疫狀態仍需深入研究。本結果對于指導小肝癌綜合治療、觀察療效、判斷預后具有參考價值。

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