人參、紅參皂苷類成分指紋圖譜研究

鄭 重，宋鳳瑞，劉淑瑩，劉志強

（1.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022；2.中國科學院研究生院，北京 100049）

人參、紅參皂苷類成分指紋圖譜研究

鄭 重1，2，宋鳳瑞1，劉淑瑩1，劉志強1

（1.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022；2.中國科學院研究生院，北京 100049）

為了建立一種快速鑒定人參和紅參的方法，應用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜研究人參和紅參中的皂苷類成分指紋圖譜。室溫下用甲醇提取人參粉末，提取液離心，并用0.22μm濾膜過濾。色譜柱是BEH Shield RP18柱（1.7μm×2.1×50mm，Waters，USA）和BEH保護柱；流動相：乙腈（A），水（B）；0～5min A從25%到50%，5～8min，A從50%變化到90%，8～10min，A從90%變到100%，10～12min，A保持在100%；進樣體積10μL，檢測波長195nm。質(zhì)譜噴霧電壓－4.5kV，金屬毛細管電壓－45V，溫度250℃，殼氣（氮氣）流速27L/h，輔助氣（He）流速180L/h，質(zhì)量掃描范圍m/z200～1 500，碰撞氣為氦氣，質(zhì)譜碎裂信息用來鑒定皂苷。液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)顯示在人參炮制過程中化學成分發(fā)生了變化，結果表明不同批次的人參與紅參能夠清晰分組。該方法快速，簡單，特征性和重現(xiàn)性良好。

人參；紅參；人參皂苷；指紋圖譜；多元統(tǒng)計分析

人參為五加科Araliaceae植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，是名貴中藥材，紅參是人參的熟用品，其加工方法是經(jīng)過浸潤、清洗、分選、蒸制、晾曬、烘干等工序而成［1］。因為熱處理紅參在蒸制過程中會發(fā)生化學反應，導致成分上發(fā)生變化。人參和紅參中所含成分很多，主要活性成分是人參皂苷。人參皂苷有抗腫瘤、增強免疫力、抗衰老等廣泛的藥理活性。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，它建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。隨著HPLC-MS和GC/MS等聯(lián)用技術的發(fā)展，中藥指紋圖譜技術趨于完善［2－4］，高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術的首選方法。本工作在樣品簡單預處理后，應用超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術測定人參（即未經(jīng)處理的原人參）和紅參（由原人參加工而成）中皂苷類的化學成分，系統(tǒng)地觀察經(jīng)過蒸制其化學成分發(fā)生變化的規(guī)律，為人參樣品的快速鑒別提供參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LTQ超高效液相色譜－質(zhì)譜系統(tǒng)：美國Thermo公司產(chǎn)品；H-class超高效液相色譜系統(tǒng)：美國 Waters公司產(chǎn)品；電子分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；5810R高速離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

人參、紅參藥材：由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所提供；標記為 Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rg2、Rg3、Rd的人參皂苷：由吉林大學藥學院提供；乙腈（色譜純）：美國Fisher試劑公司產(chǎn)品；其他試劑（分析純）：北京化工廠產(chǎn)品；水為 Milli－Q超純水（18.2MΩ·cm）。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件Waters Acquity BEH Shield RP18色譜柱（1.7μm×2.1×50mm），Waters BEH RP18保護柱，柱溫25℃；樣品進樣量10μL；流動相為乙腈和水，采用二元線性梯度洗脫，流速0.3mL/min；檢測波長195nm。

1.2.2 質(zhì)譜條件 噴霧電壓4.5kV；金屬毛細管電壓4.5V；溫度250℃；鞘氣為N2，流速30 arb；輔助氣體為He，流速10arb；分析條件采用負離子模式，掃描范圍為m/z200～1 500。

1.3 樣品制備

精密稱取1g藥材人參，加入30mL甲醇，浸泡過夜，超聲60min，以5 000r/min離心10 min，過0.22μm濾膜，備用。

1.4 樣品測試

本研究系統(tǒng)地觀察了樣品的測試情況：1）精密度實驗：連續(xù)進樣5次，其色譜圖中各色譜峰的相對保留時間RSD為0.11%，相對峰面積的RSD為0.25%；2）重現(xiàn)性實驗：取同一批人參藥材制備溶液5份，各色譜峰的相對保留時間RSD均小于0.25%，相對峰面積的RSD均小于1.94%，重現(xiàn)性較好；3）穩(wěn)定性實驗：取同一人參樣品試液，分別于第0、4、8、12、24h測定，各色譜峰的相對保留時間RSD均小于0.08%，相對峰面積的RSD均小于2.54%，說明樣品至少在24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

1.5 測試結果

不同批次的原人參和紅參的超高效液相色譜指紋圖譜示于圖1和圖2。不同批次的原人參由于產(chǎn)地、生長年限等因素，其譜圖有所差異；而經(jīng)過加工后制成紅參的色譜圖相似度比原人參高。

圖1 不同批次人參指紋圖譜Fig.1 Fingerprint graphs of ginsengs for different batches

圖2 不同批次紅參樣品指紋圖譜Fig.2 Fingerprint graphs of red ginsengs for different batches

2 結果與討論

人參的有效成分是人參皂苷，而不同的人參皂苷其基本結構是相似的：由30個碳原子排列成4個環(huán)的甾烷類固醇核。它們依據(jù)苷元結構的不同而被分為兩組：達瑪烷型和齊墩果烷型。達瑪烷類型又被分為兩類：原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷，其骨架結構示于圖3。它們的區(qū)別在于：當R3為羥基時，是原人參三醇型皂苷；當R3為氫時，是原人參二醇型皂苷。

原人參二醇型皂苷有：Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、（20R）-Rg3、Rh2、（20R）-Rh2、Rs1、Rs2、Rs3、F2、Malonyl-Rb1、Quinguenoside-R1、Malonyl-Rb2、Malonyl-Rc、Malonyl-Rd、Notoginsenoside-R4、Rg5、Rh3、Rs4、Rk1、Rs5；原人參三醇型皂苷有：Re、Rf、20-gluco-Rf、Rg1、Rg2、（20R）-Rg2、Rh1、（20R）-Rh1、Notoginsenoside-R1、Notoginsenoside-R2、F1、Rh4、F4、Rs6、Rg6、Rk2、Rk3、Rs7、25-hydroxy－gindenoside-Rg2、 25-hydroxy－gindenoside-Rh1、 Ia、Ib［5－7］。部分原人參二醇型和原人參三醇型皂苷的結構信息列于表1。

圖3 原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的結構式Fig.3 Structures of panaxadiol ginsenosides and panaxatriol ginsenosides

表1 部分原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的結構Table 1 Structures of some panaxadiol ginsenosides and some panaxatriol ginsenosides

齊墩果烷型皂苷為Ro，其結構示于圖4。

圖4 人參皂苷Ro的結構Fig.4 Structure of ginsenoside Ro

2.1 原人參主要皂苷類成分的研究

原人參樣品色譜圖示于圖5，其中，所標記的譜峰為原人參中含有的皂苷類成分。利用UPLC-ESI-MSn技術可以先將樣品中的人參皂苷通過液相色譜分離，在電噴霧一級譜中獲得分子質(zhì)量信息，通過多級串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片信息，并由此確定苷元類型和所連糖基的種類和數(shù)量，最后確定皂苷的結構。

以圖5中峰1的ESI-MS2數(shù)據(jù)為例來說明人參皂苷的鑒定方法。峰1的二級串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖6。m/z945是峰1的準分子離子峰［M－H］-，其相對分子質(zhì)量可以推測為946。觀察到m/z799的碎片離子峰是m/z945丟失一分子鼠李糖基，m/z783的碎片離子峰是m/z945丟失一分子葡萄糖基，m/z637的碎片離子峰是m/z945丟失一分子鼠李糖基同時失去一分子葡萄糖基，m/z475的碎片離子峰是m/z945丟失一分子鼠李糖基同時失去二分子葡萄糖基，這與人參皂苷Re標準品的ESI-MS2信息相同，且色譜保留時間一致，可推斷此峰為人參皂苷Re［8］。用同樣的方法可以判定所測得的其它UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)，即可進行各色譜峰的歸屬［8－17］，結果列于表2。

圖5 原人參樣品皂苷類成分的色譜圖Fig.5 Chromatogram of ginsenosides for ginseng

圖6 峰1的二級串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MS2 spectrum of peak 1

2.2 紅參的主要皂苷類成分的研究

紅參樣品的色譜圖示于圖7。其中，所標記的譜峰為紅參中含有的皂苷類成分。按照2.1所述方法確定各譜峰對應皂苷的結構，其中保留時間為8.9min的色譜峰所對應的物質(zhì)在紅參中的含量顯著升高，但它與其它皂苷成分不同，該物質(zhì)在質(zhì)譜正負離子掃描模式下均沒有信號響應，所以初步判定其不是皂苷類成分。由于紅參中含有皂苷類成分與原人參中的皂苷種類大體相同（人參皂苷Ro和原人參二醇在原人參樣品中未被檢出），但含量有所區(qū)別，其結果列于表2。

2.3 原人參、紅參皂苷類成分的主要區(qū)別

從譜峰信息中可以看出：人參皂苷Rg3、Rg5、Rk1、F和原人參二醇在紅參中的含量明顯高于在生曬參（即原人參）中的含量。有報道，紅參中的丙二酰基人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量明顯低于生曬參中的含量［18］。說明在紅參加工過程中，人參皂苷發(fā)生糖苷鍵斷裂進而轉換成相應的苷元或次生苷。皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的20位糖基很不穩(wěn)定，容易被水解產(chǎn)生Rg3；并且20位羥基也不穩(wěn)定，容易以水分子形式脫掉，形成雙鍵，生成不飽和的人參皂苷Rk1與Rg5。皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的20位糖基與3位糖基均被水解，生成原人參二醇。人參皂苷Re的20位糖基不穩(wěn)定，容易被水解，生成Rg2，Rg2在20位發(fā)生了脫水反應，生成不飽和的人參皂苷F4。Rg1的20位糖基水解，再脫去一分子，水在20與22位間形成雙鍵，生成人參皂苷Rh4［19］。Ro在紅參中被大量發(fā)現(xiàn)，而在生曬參中沒有出現(xiàn)相應的譜峰。m/z793的化合物為Ro脫掉一個六碳糖基生成的產(chǎn)物。

表2 原人參、紅參樣品中各色譜峰的LC/MS2鑒定Table 2 The MS2 information of LC peaks in ginseng and red ginseng

圖7 紅參樣品皂苷類成分的色譜圖Fig.7 Chromatogram of ginsenosides for red ginseng

2.4 原人參、紅參在藥理活性上的區(qū)別

原人參與紅參都具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津止渴、安神益智等功效。但二者的用法不同：原人參性平，是日常保健常用的補品；紅參是原人參的熟用品，性溫，具有藥效強勁之特點，是陰盛陽虛者的首選補品。

原人參、紅參中的主要藥效成分是人參皂苷，它們有著廣泛的藥理活性［20］。近年來，人參皂苷的抗腫瘤活性研究成為熱點，眾多研究表明，它具有較高的抗腫瘤活性，與化療藥物（如順鉑）聯(lián)合應用有協(xié)同作用。人參皂苷抗腫瘤活性受母核影響：齊墩果酸型＞原人參二醇型＞原人參三醇型；抗腫瘤活性受糖鏈影響：苷元＞單糖苷＞二糖苷＞三糖苷＞四糖苷；抗腫瘤活性受C20構型影響：20（R）-人參皂苷＞20（S）-人參皂苷。由于原人參加工成紅參的過程中，部分原人參三醇型皂苷轉化成為原人參二醇型皂苷及苷元，且有顯著量的人參皂苷Ro產(chǎn)生，因此紅參抗腫瘤活性大于原人參。

2.5 原人參和紅參樣品的模式識別

模式識別有多種方法，主成分分析（PCA）是其中的一種方法。這種方法是將原變量進行線性組合得到新的變量，常稱為主成分。以攜帶信息量最大的主成分1和主成分2的得分為坐標，所得樣品的散點圖即可用于模式識別。

為了進一步觀察原人參和紅參的區(qū)別，本工作運用多元統(tǒng)計分析軟件SIMCA-P［21］對原人參和紅參進行分類研究。該軟件分別在樣品得分1和得分2的基礎上，由顯著性檢驗計算出臨界點，于是可繪制一臨界點橢圓圖，示于圖8。即在橢圓內(nèi)的點為正常樣品，落于橢圓外的點為異常樣品。

由圖8可見，原人參和紅參很清楚地散落在兩個不同的區(qū)域。假若有一未知樣品，知道其落點的位置則可判斷屬于哪種人參。由此，模式識別的結果對于判別“真”和“假”是一種有效的手段，具有重要的實際應用價值。

圖8 PLS-DA樣品分布得分圖（score plot）Fig.8 PLS-DA model of ginseng and red ginseng score plot

3 結論

應用UPLC-MSn技術實現(xiàn)了對人參、紅參藥材皂苷類成分的快速分析檢測，提供了豐富的譜圖信息，經(jīng)統(tǒng)計學軟件SIMCA-P分析能夠清晰的分組。通過對原人參、紅參差異性成分的確認，解釋了皂苷類成分在人參炮制成紅參過程中所發(fā)生的化學變化。

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Fingerprint Study on Ginsenoside in Ginseng and Red Ginseng

ZHENG Zhong1，2，SONG Feng-rui1，LIU Shu-ying1，LIU Zhi-qiang1
（1.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Science，Changchun130022，China；2.Graduate School of Chinese Academy of Science，Beijing100049，China）

A rapid analysis method was established to identify ginseng and red ginseng.Ginsenosides in ginseng and red ginseng were studied as the fingerprint compounds by ultrahigh performance liquid chromatography-electrospray ionization multistage tandem mass spectrometry（UPLC-ESI-MSn）.Power of ginseng sample was extracted with methanol at room temperature.The extract was centrifuged and filtered through a 0.22μm filter before analyzed by UPLC-MS.UPLC separations were carried out using a BEH Shield RP18column（1.7μm×2.1×50mm，Waters，USA）and a BEH RP18guard column（Waters）.The column temperature was kept at 25℃.The flow rate was set to 0.3mL/min，and the eluting gradient was as follows：［acetonitrile（A）and water（B）］：0—5min，25%—50%A；5—8min，50%—90%A；8—10min，90%—100%A；10—12min，100%A.The injection volume was 10μL.The detection wavelength was 195nm.The mass spectrometer was op－erated in the negative ion mode with source voltage of 4.5kV.The metal capillary voltage was 45V，and temperature was 250℃.The sheath gas（N2）flow-rate was 27L/h，the auxiliary gas（He）flow-rate was 180L/h.The scan range was m/z 200—1 500.Helium was used as collision gas，and collision energy was adjusted for the intensity ratio of the base peak to the parent ion between 2and 20.The fragments got from ESI-MSnsupplied very important information to identify the ginsenosides.The data of the UPLC-ESI-MSnfor ginseng samples and red ginseng samples revealed that the chemical composition changes during the red ginseng steaming process.The result shows different batches of ginseng and red ginseng are clearly distinguished，which explain the chemical composition changes during the red ginseng steaming process.The method is rapid，simple，characteristic and good reproducibility.

ginseng；red ginseng；ginsenoside；fingerprint；multivariate statistical analysis

O 657.63

A

1004-2997（2012）06-0327-07

2012-10-14；

2012-10-30

國家自然科學基金項目（20953001），吉林省與中國科學院科技合作資金項目（2010SYHZ0052，2011CJT0015）資助

鄭 重（1978～），男（漢族），吉林長春人，助理研究員。E-mail：zhengzh＠ciac.jl.cn

劉志強（1962～），男（漢族），吉林人，研究員，從事天然藥物化學與有機質(zhì)譜學研究。Email：liuz＠ciac.l.cn