液相色譜－串聯質譜法測定飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物

應永飛，朱聰英，韋敏玨，陳慧華，周 煒，林仙軍，汪以真

（1.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058；2.浙江省畜產品質量安全檢測中心，浙江 杭州 310020）

液相色譜－串聯質譜法測定飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物

應永飛1，2，朱聰英2，韋敏玨2，陳慧華2，周 煒2，林仙軍2，汪以真1

（1.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058；2.浙江省畜產品質量安全檢測中心，浙江 杭州 310020）

采用高效液相色譜－電噴霧串聯質譜（LC-ESI-MS-MS）在多反應監測（MRM）模式下，建立飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物（三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺）的快速確認檢測方法。試樣中的三聚氰胺及其類似物經甲酸－乙腈溶液提取，氮氣吹干，用定容液溶解后，進行液相色譜－串聯質譜測定，采用色譜保留時間和質譜碎片離子豐度比定性，以15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸作為內標進行定量。采用正離子掃描和負離子掃描的方式進行儀器方法學研究，確定豐度比最高的兩對離子作為監測離子，進行MRM模式定性定量分析。該方法的檢出限（LOD）為0.25～0.50mg/kg；在5.0～500.0μg/L的線性范圍內，相關系數r均大于0.999。在0.5～2.0mg/kg的添加水平上，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的回收率為61.4%～115%，相對標準偏差不大于12.6%。

液相色譜－串聯質譜法（LC-MS/MS）；飼料；土壤；三聚氰胺；類似物

三聚氰胺（melamine，MEL）是一種重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺樹脂，是建筑業中常用的防火材料，與飼料行業毫不相干，但是2007年3月發生在美國的數起飼料致寵物死亡事件使兩者聯系在一起［1］。2008年9月我國又發生了在嬰幼兒奶粉中添加三聚氰胺的事件，一時間由三聚氰胺造成的食品安全問題引起了廣大人民群眾的恐慌。有證據顯示，三聚氰胺在哺乳動物體內并不能被肝臟進行生物轉化代謝，但當三聚氰胺與其類似物三聚氰酸（cyanuric acid，CYA）同時存在時，二者能夠依靠分子結構上的氫氧基與氨基之間形成水合鍵（氫鍵），從而將二者連接起來，這種連接可以反復進行，最終形成一個網格結構，從而形成腎結石和尿結石等，造成泌尿系統功能障礙［1－2］。三聚氰胺類似物除三聚氰酸外，還包括三聚氰酸一酰胺（ammelide，AMD）、三聚氰酸二酰胺（ammeline，AMN）等，這些化合物均可以相互作用而形成網狀物，造成結石，同時監測三聚氰胺及其類似物的污染情況比僅僅監測三聚氰胺更具現實意義。完善三聚氰胺污染調查檢測技術體系，必須了解飼料污染情況和導致飼料三聚氰胺污染的原因，作為植物源性飼料生長基本要素的土壤有可能是造成污染的原因之一。因此，為了進一步摸清動物源食品中三聚氰胺的污染源和污染途徑，建立飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物的同時、快速檢測技術尤為迫切。

目前，國內外文獻中尚未見同時檢測飼料和土壤中4種三聚氰胺及其類似物的方法，已有的檢測方法主要以三聚氰胺或三聚氰胺和三聚氰酸同時檢測研究為主［3－4］。農業行業標準 NY/T1372建立了飼料中三聚氰胺的高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜－質譜法（GC/MS）［5］；李愛軍等［6］建立了液相色譜－串聯質譜法（LCMS/MS）測定飼料中三聚氰胺；Ge等［7］建立了LC-MS/MS法測定土壤中三聚氰胺。同時檢測4種三聚氰胺及其類似物主要以生鮮乳或動物源性食品為主，主要有毛細管膠束電動色譜法（MEKC）［8］、GC/MS 法［9－10］和 LC-MS/MS法［11－13］等，這些方法較好的解決了4種三聚氰胺及其類似物的檢測問題。但由于未建立飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物的同時檢測技術，無法進行該系列樣品準確的定性和定量分析，從而使污染源調查工作不能深入開展，因此完善三聚氰胺污染源檢測技術體系尤為必要。GC/MS法和LC-MS/MS法因集高效分離和多組分定性、定量于一體，成為近年來研究三聚氰胺及其類似物的主要方法，特別是LC-MS/MS法無需衍生等繁瑣的前處理過程，已成為三聚氰胺及其類似物檢測的主要手段。本研究采用LC-MS/MS法檢測飼料和土壤中三聚氰胺及其類似物，對樣品前處理方法和儀器分析條件進行系統優化，為開展三聚氰胺及其類似物的污染源調查、系統了解其環境遷移行為提供全面的檢測技術。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Waters Alliance 2695液相色譜儀-Micromass Quattro Micro三重四極桿串聯質譜儀：美國Waters公司產品，配MassLynx V4.0軟件；3k30型冷凍離心機：美國Sigma公司產品；MS2minishaker旋渦混勻器：IKA公司產品；AG-285電子天平：Mettler公司產品；12位水浴型氮吹儀：美國Organomation公司產品。

三聚氰胺：購自國家標準物質研究中心；三聚氰酸標準品（純度大于98.0%）：Dr.Ehrenstorfer公司產品；內標物15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸（純度均大于99.0%）：WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH 產品；甲醇、乙腈（HPLC級）：Merck公司產品；甲酸（純度為99%）：Acros Organics公司產品；實驗用水為milli-Q超純水；其它試劑均為分析純。

分別精密稱取10mg三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺于100mL容量瓶中，三聚氰胺、三聚氰酸用水溶解后定容；三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺用2%氨水溶液溶解后定容，置于0～4℃冰箱中保存。分別吸取適量的各標準品儲備液置于同一容量瓶中，用甲醇溶解制成1.0mg/L標準品工作液。內標溶液配制成1.0mg/L的15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸工作液。

1.2 樣品前處理

稱取2.0g（精確至0.001g）試樣于50mL容量瓶中，加40mL提取液（取500mL 2.5%甲酸溶液，用乙腈定容至1 000mL），加蓋，振蕩60s，于超聲波清洗器中超聲提取20min；取出冷卻后，定容至刻度，搖勻；取5mL上清液至離心管中，以14 000r/min離心20min；準確量取1.0mL上清液，加50μL內標工作液，渦旋混勻，50℃下氮氣吹干；加定容液（取100mL 0.2%甲酸溶液，用乙腈定容至1 000mL）定容至1.0mL，充分溶解，溶解液過0.22μm微孔濾膜后，進行LC-MS/MS分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis HILIC柱（2.1mm×150mm×3.5μm）；柱溫30℃，進樣量20μL。流動相組成及配比列于表1。

表1 流動相組成及配比Table 1 Gradient mobile phase for HPLC

1.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式和正離子模式分段進行采集，離子源溫度110℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣和錐孔氣為N2，脫溶劑流速600L/h，錐孔氣流50 L/h，光電倍增器電壓650V。三聚氰胺采用正離子監測方式，毛細管電壓3.0kV，萃取電壓2 V；三聚氰酸采用負離子監測方式，毛細管電壓3.3kV，萃取電壓2V。碰撞氣為高純氬氣，控制碰撞室的壓力為0.3Pa。采用MRM多反應監測方式。母離子（Q1）/子離子（Q3）離子對均設為單位分辨，各離子對的駐留時間均為100 ms，具體監測條件列于表2。

2 結果與討論

2.1 質譜定性定量分析

三聚氰胺及其類似物屬于極性化合物，水溶性較好，其中三聚氰酸存在酮式和烯醇式兩種互變異構體，以烯醇式為主。由于三聚氰胺含有氨基，容易得到質子，可采用ESI＋模式監測準分子離子［M＋1］＋，而三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺含有羥基，容易失去質子，采用ESI-模式監測準分子離子［M－1］-。在優化三聚氰酸二酰胺時，發現ESI＋和ESI-模式下各有一對離子的響應值較高，而另外一對離子的響應值均較低，無法滿足檢測需要，為達到歐盟2002/657/EC［14］規范關于殘留檢測化合物定性的要求，采用同時監測ESI＋和 ESI- 模式下的m/z128.0/86.0和m/z126.0/83.0離子對，得到了最大的檢測靈敏度。本標準參考FDA［13］的方法進行同時檢測，分段采集，以20mmol/LV（甲酸銨）∶V（乙腈）＝50∶50的溶液為基準流動相，采用流動注射泵連續進樣，對三聚氰胺及其類似物和兩種內標物的質譜條件進行優化，在正離子模式和負離子模式下進行全掃描，以選擇適當的分子離子峰和電離方式。根據不同化合物的響應和保留時間差異，設置2個通道分兩段進行監測。結合基質空白和基質標準液的離子掃描圖，優化參數，從而相應的確定了各種藥物在多反應監測模式下信號采集的特征離子對，列于表2。子離子掃描圖示于圖1。采用正離子模式監測三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺（m/z128.0/86.0），負離子模式監測三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺（m/z126.0/83.0），并對離子源和碰撞能量等相關參數進行優化，鑒別點（IPs）均能滿足歐盟2002/657/EC的決議要求［14］。

表2 三聚氰胺及其類似物的MRM監測條件Table 2 MRM optimization conditions of melamine and its analogues

圖1 三聚氰胺及其類似物與內標物的子離子掃描圖Fig.1 Daughter scan of melamine and its analogues

2.2 液相色譜條件的優化

由于三聚氰胺及其類似物的極性較強，采用親水反應離子交換色譜柱（HILIC柱）可以實現很好的分離，因此得到廣泛應用。比較了 Waters XBridgeTMAmide柱（4.6mm×150mm×5.0μm）、Waters XBridgeTMHILIC柱（4.6mm×150mm×3.5μm）、Agilent Rx Sil（2.1mm×150mm×5.0μm）、Waters Atlantis HILIC柱（2.1mm×150mm×3.0μm）和 Merck ZICHILIC柱（2.1×150mm×5μm）等一系列分離色譜柱，發現采用改良后FDA色譜條件，氨基柱的分離效果較差，而在HILIC色譜柱上均可以得到較好的色譜峰型和色譜保留時間，響應值差別不大，均可滿足要求，因此選用 Waters XBridgeTMHILIC柱作為分離柱進行研究。實驗過程中，流動相的比例對三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的影響特別顯著，當流動相的梯度比例由（80/20）變為（60/40）時，目標物的保留時間基本一致，但靈敏度降低5倍以上。因此，本方法最終確定了列于表1的液相色譜條件，此時的MRM色譜圖示于圖2。由圖2可以看出，目標物得到了滿意的分離及響應值。樣品定容液是影響三聚氰酸峰型和響應值的重要因素，本研究采用Waters XBridgeTMHILIC色譜柱，比較了不同定容液對靈敏度的影響，發現采用V（0.2%甲酸）∶V（乙腈）＝10∶90的溶液定容時，色譜峰型和靈敏度最佳。

2.3 樣品前處理方法的確定

采用提取劑提取被測樣品后，考慮將SPE凈化方法作為樣品處理的主要方法，但是飼料中特別是預混合飼料中鹽分過高，凈化過程困難，先后比較了MAX、MCX、CARB等SPE柱凈化均未能取得滿意的凈化效果和回收率，因此采用文獻的方法經提?。?，10］，氮氣吹干，高速離心后進行凈化，得到了較為滿意的凈化效果。

由于三聚氰胺及其類似物的水溶性較好，提取時往往采用酸性水溶液，如三氯乙酸、甲酸或它們與乙腈組成的混合溶液。本標準比較了不同提取溶液的效果，分別采用1.0%三氯乙酸、V（1.0%三氯乙酸）∶V（乙腈）＝1∶1溶液、2.5%甲酸溶液、V（2.5%甲酸溶液）∶V（乙腈）＝1∶1溶液提取三聚氰胺及其類似物，發現采用V（2.5%甲酸溶液）∶V（乙腈）＝1∶1的溶液提取效果最好。該結果與文獻報道的基本一致［1］。由于三聚氰胺和三聚氰酸容易形成聚合物，因此為了盡可能地使被測物以游離形式存在，本研究采用超聲提取法，盡量提高被測物的提取效率和聚合物解離。通過土壤和飼料樣品的加標實驗，表明采用超聲提取方法的回收率均在90%以上。由于提取液中有大量的機械雜質，通過高速離心可以有效除去，以達到較好的凈化效果。

圖2 MRM模式下，三聚氰胺及其類似物標準品色譜圖Fig.2 The selected ion chromatogram of melamine and its analogues in MRM mode

2.4 方法線性方程和檢出限

配制與檢測樣品相同基質的混合標準系列工作液，使其濃度為 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500μg/L，內標物濃度均為50.0μg/L，按1.3建立的儀器條件進行測定。分別以選定的定量離子峰面積與內標物峰面積的比值Y對含量X做標準曲線，采用空白樣品中添加目標化合物的方法，按樣品處理方法進行處理和檢測，以3倍信噪比為檢出限（LOD），以10倍信噪比為定量限（LOQ），其結果列于表3。

2.5 加標回收率和精密度實驗

在確定樣品預處理方法后，取酸性土壤（acid soil，AS）、中性土壤（neutral soil，NS）和堿性土壤（basic soil，BS）作為土壤代表性樣品，取豬飼料（swine’s feed，SF）和雞飼料（chicken’s feed，CF）作為飼料代表性樣品，進行加標回收率實驗，以考察方法的準確度和重現性，每批次內同一濃度做5次平行實驗，回收率結果列于表4。當樣品的上機液濃度超過線性范圍時，需根據測定量濃度，減少取樣量進行重新測定，直至上機液濃度在標準曲線的線性范圍內。

表3 三聚氰胺及其類似物的線性方程、相關系數和檢出限（n＝6）Table 3 The calibration curves，corelation coeffient and LOD of melamine and its analogues（n＝6）

由實驗結果看出，按優化后的樣品提取條件和色譜條件測定添加回收量，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的平均回收率為61.4%～115%，相對標準偏差不大于12.6%。該結果說明，本工作建立的方法對不同含量、不同樣品中三聚氰胺及其類似物的測定均有較好的準確度。

2.6 樣品分析

利用建立的方法進行了部分樣品的摸底檢測，土壤樣品主要來源于養殖場、種植場和飼料廠等周圍的上層、中層和深層土壤，飼料樣品包括魚粉、植物原料飼料和畜禽配合飼料、預混合飼料、濃縮飼料等。結果發現，土壤和飼料樣品中普遍存在三聚氰胺和三聚氰酸的污染情況。對196份土壤和230份飼料樣品的檢測發現：32份土壤樣品中檢出三聚氰胺，7份土壤樣品中檢出三聚氰酸，其含量為0.59～41.1mg/kg；25份飼料樣品中檢出三聚氰胺，1份飼料樣品檢出三聚氰酸。

［1］HELLER D N，NOCHETTO C B.Simultaneous determination and confirmation of melamine and cyanuric acid in animal feed by zwitterionic hydrophilic interaction chromatography and tandem mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2008，22：3 624-3 632.

［2］CIANCIOLO R E，BISCHOFF K，EBEL J G，et al.Clinicopathologic，histologic，and toxicologic findings in 70cats inadvertently exposed to pet food contaminated with melamine and cyanuric acid［J］.J Am Vet Med Assoc，2008，233：729-737.

［3］VENKATASAMI G，SOWA JR J R.A rapid，acetonitrile-free，HPLC method for determination of melamine in infant formula［J］.Analytica Chimica Acta，2010，665（2）：227-230.

［4］FILAZI A，SIRELI U T，EKICI H，et al.Determination of melamine in milk and dairy products by high performance liquid chromatography［J］.J Dairy Science，2012，95（2）：602-608.

［5］國家飼料質量監督檢驗中心.NY/T 1372—2007飼料中三聚氰胺的測定［S］.北京：中國農業出版社，2007.

［6］李愛軍，張代輝，馬書民，等.液相色譜－串聯質譜法測定飼料中三聚氰胺殘留［J］.分析化學，2008，36（5）：699-701.

［7］GE J，ZHAO L W，LIU C Y，et al.Rapid determination of melamine in soil and strawberry by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food Control，2011，22（10）：1 629-1 633.

［8］陳 新，袁紅萍，曹玉華，等.膠束毛細管電動色譜法在線富集聯用技術靈敏檢測乳制品和飼料樣品中的三聚氰胺［J］.分析化學，2010，39（9）：1 418-1 422.

［9］MIAO H，FAN S，WU Y N，et al.Simultaneous determination of melamine，ammelide，ammeline，and cyanuracid in milk and milk products by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Biom Envir Sci，2009，22：87-94.

［10］朱聰英，應永飛，羅成江，等.GC-MS法同時測定生鮮乳中三聚氰胺及其類似物的研究［J］.中國飼料，2011，22：27-31.

［11］YU H，TAO Y，CHEN D，et al.Development of a high performance liquid chromatography method and a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method with pressurized liquid extraction for simultaneous quantication and confirmation of cyromazine，melamine and its metabolites in foods of animal origin［J］.Analytica Chimica Acta，2010，682（1/2）：48-58.

［12］ANDERSENW C，TURNIPSEED S B.Determination and confirmation of melamine residues in catfish，trout，tilapia，salmon，and shrimp by liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］.J Agric Food Chem，2008，56（12）：4 340-4 347.

［13］SMOKER M，ALEXANDER J K.U.S.FDA，Method for determination of melamine and cyanuric acid residues in foods using LC-MS/MS laboratory information bulletin.LIB No.4 422，2008［EB/OL］.http：//www.cfsan.fda.gov/～frf/lib 4422.html.

［14］Commission of the European Communities.Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Council Directive.2002/657/EC Off.J.Eur.Commun.2002，L 222/8.

Simultaneous Determination of Melamine and Its Analogues in Feeds ＆Soils by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YING Yong-fei1，2，ZHU Cong－ying2，WEI Min-jue2，CHEN Hui-hua2，ZHOU Wei2，LIN Xian-jun2，WANG Yi-zhen1（1.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China；2.Animal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province，Hangzhou310020，China）

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-ESI-MS/MS）method for the determination of melamine and its analogues（CYA，AMD，AMN）in feeds ＆soils was reported.The analytes were extracted with the soluction（V（2.5%formic acid）∶V（acetonitrile）＝50∶50）from matrix，and then the extracting solution was evaporated by nitrogen blow，dissolved in the soluction（V（0.2%formic acid）∶V（acetonitrile）＝10∶90）and assayed by LC-MS/MS.The chromatographic retention time and mass fragment ion abundances ratio for qualitative，and with15N3－melamine，13C3－cyanuric acid as internal standard for quantitative.Scanning of positive ions and negative ion scan the instrument method studies，to determine the abundance ratio of the highest two pairs of ions as monitoring ionMRM mode for qualitative and quantitative analysis.The limit of detection （LOD）is 0.25—0.50mg/kg.The correlation coefficient is greater than 0.999within the linear range of 5.0—500.0μg/L.Recoveries of MEL，CYA，AMD and AMN are 61.4%—115%，and the relative standard deviation is less than 12.6%at spiked levels of 0.5—2.0mg/kg（n＝5）.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）；feeds；soils；melamine；analogues

O 657.63

A

1004-2997（2012）06-0342-07

2012-05-28；

2012-10-20

浙江省優先主題重點農業項目（2009C12055），浙江省重點科技創新團隊項目（2010R50028）資助

應永飛（1977～），男（漢族），博士研究生，從事飼料安全分析的研究。E-mail：yyf1001＠163.com

汪以真（1965～），男（漢族），博士，教授，從事動物營養與免疫研究。E-mail：yzwang＠zju.edu.cn