脂肪酸甲酯碳同位素測定值的校正方法對比研究

姚 遠，趙江濤，曹蘊寧，王 政，劉衛國

（1.西安交通大學，人居環境與建筑工程學院，陜西 西安 710049；2.中國科學院地球環境研究所，黃土與第四紀地質國家重點實驗室，陜西 西安 710075）

脂肪酸甲酯碳同位素測定值的校正方法對比研究

姚 遠1，2，趙江濤2，曹蘊寧2，王 政2，劉衛國1，2

（1.西安交通大學，人居環境與建筑工程學院，陜西 西安 710049；2.中國科學院地球環境研究所，黃土與第四紀地質國家重點實驗室，陜西 西安 710075）

氣相色譜－燃燒－同位素比值質譜（GC-C-IRMS）分析脂肪酸單體化合物碳同位素時，首先對脂肪酸甲酯化，但是測得的δ13C值為脂肪酸甲酯的δ13C值，因此需要對其進行數學校正，才能得到脂肪酸δ13C值。為了得到準確的甲酯化使用的甲醇δ13C值，提高校正后的脂肪酸δ13C值的精準度，本研究利用3種不同方法測定甲醇δ13C值：1）甲醇與鈉反應制備甲醇鈉固體，離線測定甲醇鈉固體δ13C值；2）液氮冷卻石英管注樣法制備甲醇結晶體，離線測定甲醇結晶體δ13C值；3）GC-C-IRMS頂空進樣測定甲醇δ13C值。并通過離線測定得到脂肪酸單體化合物及其甲酯化后的脂肪酸甲酯δ13C值。然后用此3種不同方法測定的甲醇δ13C值分別對脂肪酸甲酯δ13C值進行數學校正，將計算得到的脂肪酸δ13C值與脂肪酸單體化合物δ13C值進行誤差分析。研究結果表明：離線測定的甲醇結晶體δ13C值為－50.17‰，標準偏差為0.086‰（n＝5），重現性優于其他兩種方法，用其校正后的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值誤差最小。因此，離線測定甲醇結晶體δ13C值是一種相對可靠的測定甲醇δ13C值的方法，可提高校正脂肪酸甲酯碳同位素測定值的精準度。關鍵詞：脂肪酸甲酯；甲醇；碳同位素；校正方法

脂肪酸作為一種生物標志化合物已被廣泛應用于環境、地質、食品、生物、醫學等研究領域［1－7］。目前，隨著單體有機化合物穩定同位素分析（CSIA）技術的不斷發展，氣相色譜－燃燒－同位素比值質譜（GC-C-IRMS）技術實現了有機樣品單體化合物的在線同位素測定，已成為一種有效、準確的CSIA技術，同時也被廣泛應用到脂肪酸單體化合物碳同位素的分析和相應的研究中［8－13］。

通常，采用 GC-C-IRMS分析脂肪酸，特別是長鏈脂肪酸（12碳以上）時，一般不直接進行分析，須將它們先衍生為脂肪酸甲酯后才進行測定［8－13］。脂肪酸的甲酯化是為了把高沸點，不易揮發、氣化的脂肪酸與甲醇反應，生成相應的脂肪酸甲酯，使其變成低沸點易揮發、氣化的物質，從而降低氣化溫度，提高分離效果［14］。目前，脂肪酸的甲酯化方法可分為3類：酸催化法、堿催化法和三甲基硅重氮甲烷（TMS）法［14－15］。由于操作方便、快速，在脂肪酸單體化合物碳同位素研究中，多采用鹽酸－甲醇酸催化的甲酯化方法。

在甲酯化過程中，由于酯化甲基碳的引入使得脂肪酸碳同位素組分改變，測定的脂肪酸甲酯碳同位素值必須進行數學校正，扣除酯化甲基的碳同位素值，才能計算獲得研究所需要的脂肪酸碳同位素值。因此，得到準確的甲酯化使用的甲醇碳同位素值，將有助于提高校正后的脂肪酸碳同位素值的精準度。但是，目前對于測定甲醇碳同位素值的研究甚少，Hammer等［16］通過離線測定得到脂肪酸及其甲酯化后的脂肪酸甲酯δ13C值，然后利用質量平衡方程計算得到甲醇δ13C值為－49.7±2.5‰（n＝8），但此方法重現性較差，沒有得到精準的甲醇δ13C值。

已有研究者對揮發性有機化合物（VOCs）碳同位素值測定方法進行研究，Jochmann等［17］采用頂空進樣方式，提高了GC-C-IRMS分析VOCs碳同位素值的靈敏度。黃代寬等［18］設計了冷阱注樣－密閉石英管燃燒法制備甲酸、乙酸標準的同位素樣品，避免了制備過程中因揮發所導致的同位素分餾，并在Finnigan MAT-252氣體同位素比值質譜儀上對其碳同位素值進行測定，同時與GC-C-IRMS測定的碳同位素值進行對比。研究結果表明，離線測定甲酸、乙酸碳同位素值的方法具有極高的重現性，精密度上優于后者。由于甲醇也是一種VOCs，借鑒前人對VOCs碳同位素值測定方法的研究，本工作提出了3種不同方法測定甲醇碳同位素值：1）甲醇與鈉反應制備甲醇鈉固體，離線測定甲醇鈉固體碳同位素值；2）液氮冷卻石英管注樣法制備甲醇結晶體，離線測定甲醇結晶體碳同位素值；3）GCC-IRMS頂空進樣測定甲醇碳同位素值。

通過分析3種不同方法測定的甲醇δ13C值，將其分別對離線測定的甲酯化后脂肪酸甲酯δ13C值進行校正，并將計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值進行誤差分析，從而得出測定甲醇碳同位素值的可靠方法，進而提高校正脂肪酸甲酯碳同位素測定值的精準度。

1 試驗部分

1.1 樣品和主要試劑、儀器

脂肪酸標準單體化合 物 （C16：0、C18：0、C20：0、C24：0、C30：0）：美國 NU-CHEK 公司產品。

甲醇、甲苯（高效液相色譜級）：美國Fisher公司產品；正己烷、乙酰氯（液相色譜級）：德國Merck公司產品；氯化鈉（分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠產品。

氣相色譜－燃燒－同位素比值質譜儀（GC-CIRMS）：由Thermo Trace Ultra氣相色譜儀和燃燒裝置在線連接的Thermo Delta V同位素比值質譜儀組成；MAT-251型氣體同位素比值質譜儀：美國Thermo Finnigan公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪酸甲酯標準溶液的制備 分別取約3mg脂肪酸標準單體化合物（C16：0、C18：0、C20：0、C24：0、C30：0）于4mL小瓶中，加入2mL 鹽酸－甲醇后，在60℃下酯化12h，然后在酯化后的樣品中加入2mL 5%NaCl溶液，用1.5mL正己烷萃取3次，最后用氮氣吹干，甲苯定容至3mL，制備為脂肪酸甲酯標準溶液。

1.2.2 固體甲醇鈉的制備 稱取一定量的鈉金屬置于2mL小瓶，加入過量的甲醇至完全反應，然后在氮氣下吹至粘稠的一醇化物CH3ONa·CH3OH，再將此一醇化物在150℃下加熱，即可得到固體甲醇鈉。

1.2.3 甲醇結晶體樣品的制備 采用液氮冷卻石英管注樣法制備甲醇結晶體樣品，首先在石英管內加入氧化銅、銅絲和鉑絲，再用液氮冷卻石英管3～5min后，注入6μL甲醇溶液，冷卻5min使其完全凝固為結晶體，然后抽真空后用液化氣焊割炬將石英管開口端密封，可有效避免樣品制備過程中因揮發導致的碳同位素分餾。

1.2.4 脂肪酸和脂肪酸甲酯碳同位素值的測定

分別取約1mg脂肪酸標準單體化合物（C16：0、C18：0、C20：0、C24：0、C30：0）和1mL 制備的脂肪酸甲酯標準溶液的吹干樣品，置于石英管內，加入氧化銅、銅絲和鉑絲，抽真空后用液化氣焊割炬將石英管開口端密封，置于馬弗爐內，850℃下恒溫灼燒4h，充分氧化。樣品爐冷卻至室溫后，在真空系統中用酒精－液氮冷阱收集純化CO2氣體，最后用MAT-251型同位素質譜儀測定CO2的碳同位素。

質譜條件：離子源發射電流0.8mA，離子源真空6×10－5Pa，源磁鐵0.313T，高電壓9.99kV。

碳同位素組成的表達式為：

δ13C（‰）＝［（Rsa－Rst）/Rst］×1 000

式中：Rsa為樣品的碳同位素比值（13C/12C）；Rst為標準的碳同位素比值（13C/12C）。

碳同位素組成相對于V-PDB標準。樣品的測定精度用國家標準爐黑（GBW04407）控制，每批樣品至少帶1個工作標準，標準樣品的重復分析誤差小于0.2‰。同位素分析在中國科學院地球環境研究所同位素實驗室完成。

1.2.5 甲醇碳同位素值的測定

1）離線測定甲醇鈉固體碳同位素值

稱取約8mg固體甲醇鈉于石英管內，加入氧化銅、銅絲和鉑絲，抽真空后用液化氣焊割炬將石英管開口端密封，置于馬弗爐內，850℃下恒溫灼燒4h，充分氧化。樣品爐冷卻至室溫后，在真空系統中用酒精－液氮冷阱收集純化CO2氣體，最后用MAT-251型同位素質譜儀測定CO2的碳同位素。標準樣品的重復分析誤差小于0.2‰。

2）離線測定甲醇結晶體的碳同位素值

將密封后石英管中的甲醇結晶體樣品置于馬弗爐內，850℃下恒溫灼燒4h，充分氧化。樣品爐冷卻至室溫后，在真空系統中用酒精－液氮冷阱收集純化CO2氣體，最后用MAT-251型同位素質譜儀測定CO2的碳同位素。標準樣品的重復分析誤差小于0.2‰。

3）GC-C-IRMS頂空測定甲醇的碳同位素值

取約1mL甲醇溶液置于1.5mL小瓶中，放置1h后采用頂空進樣方式，進樣量1μL。

色譜條件：色譜柱HP-1MS型毛細管柱（60 m×0.32mm×0.25μm），樣口溫度290℃，載氣（He）流速1.0mL/min，分流比100∶1。

甲醇樣品經色譜柱后，在氧化爐980℃條件下轉化為CO2氣體，進入同位素比值質譜測定碳同位素值。

質譜條件：離子源發射電流1.5mA，離子源真空1.2×10－4Pa，高電壓3.09kV。

每6個分析樣品之間加測一個實驗室工作標準（C21、C25、C27、C29、C31和 C33共6個正構烷烴化合物），以監控實驗過程中碳同位素的重現性和準確性，分析誤差小于0.3‰。同位素分析在中國科學院地球環境研究所同位素實驗室完成。

2 結果與討論

2.1 離線測定的脂肪酸和脂肪酸甲酯δ13 C值的比較

通過離線測定脂肪酸單體化合物（C16：0、C18：0、C20：0、C24：0、C30：0）及其甲酯 化 后 的 脂肪酸甲酯δ13C值，比較兩者之間的差異，分析甲酯化對脂肪酸碳同位素分餾的影響。圖1比較了離線測定的脂肪酸和脂肪酸甲酯δ13C值，后者相對于前者均偏負（0.69‰～1.16‰），有著明顯的差異，遠遠超過離線測定δ13C值的誤差分析范圍（＜0.2‰）。因此，本研究使用的甲醇對脂肪酸甲酯化造成脂肪酸碳同位素的明顯分餾。

圖1 離線測定的脂肪酸和脂肪酸甲酯δ13C值的比較Fig.1 Comparisons ofδ13C values of fatty acids and FAMEs by off-line analysis

在甲酯化過程中，化學反應過程和甲醇的甲基碳引入脂肪酸都有可能造成脂肪酸碳同位素分餾。初步推測，甲酯化造成脂肪酸碳同位素明顯分餾可能有兩個原因：1）甲醇的甲基碳引入脂肪酸中碳同位素組分的改變；2）脂肪酸甲酯化反應過程中動力學同位素效應產生的同位素分餾。已有研究表明：如果在酯化反應過程中加入過量的甲醇，通常為定量反應，此過程不存在動力學同位素分餾效應［19］。本研究在制備脂肪酸甲酯標準溶液過程中，用2mL鹽酸－甲醇分別對約3 mg脂肪酸標準單體化合物進行甲酯化，甲醇足夠過量，并且在60℃下加熱反應12h的酯化條件保證了脂肪酸完全酯化［15］。因此，甲酯化反應過程中不存在動力學同位素分餾。從而推斷，酯化甲基碳的引入是造成脂肪酸碳同位素分餾的主要原因。

2.2 3種不同方法測定的甲醇δ13 C值校正脂肪酸甲酯δ13C值的對比

由于甲醇甲基碳的引入造成脂肪酸碳同位素的明顯分餾，所以，有必要對甲酯化后的脂肪酸甲酯δ13C值進行數學校正，以得到所需的脂肪酸δ13C值。一個給定的脂肪酸甲酯的碳同位素組成是脂肪酸中每個碳和酯化甲基碳共同貢獻的結果，而酯化甲基碳同位素組成應該與酯化使用的甲醇一致。只有扣除酯化甲基碳同位素的貢獻，才能獲得脂肪酸碳同位素的組成［20］。Duan等［21］和 Dungait等［22］利用質量平衡方程對脂肪酸甲酯碳同位素值進行了校正，校正公式如下：式中：n、δ13CFA分別為脂肪酸的碳數和碳同位素組成；δ13CFAME為脂肪酸甲酯的碳同位素組成；δ13CCH3OH為酯化使用的甲醇的碳同位素組成。

對于甲醇碳同位素組成的測定，采用以下3種不同方法：1）甲醇與鈉反應制備甲醇鈉固體，離線測定甲醇鈉固體碳同位素值；2）液氮冷卻石英管注樣法制備甲醇結晶體，離線測定甲醇結晶體碳同位素值；3）GC-C-IRMS頂空進樣測定甲醇碳同位素值。測定的甲醇δ13C值列于表1。離線測定甲醇鈉固體δ13C值為－51.79‰ ±0.814‰（n＝5）；離線測定甲醇結晶體δ13C值為－50.17‰ ± 0.086‰（n＝5），GC-C-IRMS頂空進樣測定甲醇δ13C值為－50.59‰ ±0.185‰（n＝5），3種方法測定的甲醇δ13C值之間有著明顯的差異。為了分析這3種方法測定甲醇δ13C值的準確性，分別將此3種方法測定的甲醇δ13C值與離線測定的脂肪酸甲酯δ13C值代入公式（1）進行校正，計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值進行誤差分析，結果列于表2。

表2 3種不同方法測定的甲醇δ13C值校正脂肪酸甲酯δ13C值的對比Table 2 Comparisons of three different determination methods ofδ13C values of the methanol to correctδ13C values of FAMEs

由表2可以看出，誤差2（0.04‰～0.16‰）和誤差3（0.06‰～0.18‰）較小，且幾乎相等，均在離線測定δ13C值的誤差分析范圍（＜0.2‰）之內，而誤差1（0.12‰～0.25‰）相對于誤差2和誤差3較大，其中脂肪酸C18和C24的誤差1分別為0.25‰、0.23‰，超過離線測定δ13C值的誤差分析范圍。由此可以初步認為，離線測定的甲醇結晶體δ13C值和GC-C-IRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值都接近于理論值，而離線測定的甲醇鈉固體δ13C值相對于理論值誤差較大。

在制備甲醇鈉固體過程中，本研究參考董紅健［23］研制的制備固體甲醇鈉方法，在金屬鈉中加入過量甲醇，反應完全后將產物濃縮至分離出一醇化物CH3ONa·CH3OH，再將此一醇化物在150℃下加熱，即可制備得到固體甲醇鈉，但此方法很難得到純度100%的甲醇鈉固體。另外離線測定5個平行實驗制備的甲醇鈉固體樣品的δ13C值標準偏差為0.814‰，重現性較差，這也有可能是CH3ONa·CH3OH在制備甲醇鈉固體過程中碳同位素分餾大小的不同所導致的。因此，沒有制備得到純度100%的甲醇鈉固體以及化學反應過程中動力學同位素效應都有可能產生甲醇碳同位素的分餾。由此推斷，離線測定的甲醇鈉固體δ13C值相對于理論值誤差較大的原因是在制備甲醇鈉固體過程中產生較大的碳同位素分餾。

在采用液氮冷卻石英管注樣法制備甲醇結晶體過程中，預先用液氮冷卻石英管3～5min，再往石英管中注入6μL甲醇，冷凍5min，凝固為結晶體后抽真空，用液化氣焊炬將石英管密封。由于注入的甲醇量很少以及甲醇易揮發的物理性質，在注入石英管過程中，有少量甲醇揮發，從而使制備的甲醇結晶體產生微弱的碳同位素分餾，導致用離線測定的甲醇結晶體δ13C值校正后的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值有微小誤差。

GC-C-IRMS頂空進樣方式是揮發性、半揮發性有機物理想的進樣技術，Slater等［24］實驗證實，氣相（頂空）中的δ13C值代表了液相中的δ13C值，兩者的同位素差異均在誤差分析范圍之內。因此，甲醇頂空進樣方式幾乎不產生碳同位素分餾。但已有研究表明：GC和IRMS的測定條件都有可能影響GC-C-IRMS對穩定同位素的分析［25－26］。因此認為，GC-C-IRMS頂空進樣方式測定的甲醇δ13C值對脂肪酸甲酯δ13C值校正后，計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值有微小誤差的原因是GC-CIRMS系統本身測定條件影響的。

2.3 離線測定的甲醇結晶體δ13 C值和GC-CIRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值比較

以上研究表明：離線測定的甲醇結晶體δ13C值和GC-C-IRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值都接近于理論值。為了驗證這兩種方法測定的甲醇δ13C值哪個更接近于理論值，首先使用獨立樣本T檢驗研究這兩種方法測定的甲醇δ13C值是否存在顯著差異，結果列于表3。若這兩種方法測定的甲醇δ13C值不存在顯著差異，說明兩者的甲醇δ13C值都接近于理論值；若存在顯著差異，說明其中的一種方法測定的甲醇δ13C值更接近于理論值。

如表3所示，甲醇δ13C值的T統計值為4.683，對應雙尾相伴概率為0.002，小于顯著性水平0.05，因此認為這兩個樣本的均值有顯著差異。說明離線測定的甲醇結晶體δ13C值和GC-C-IRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值有顯著差異，其中一種方法測定的甲醇δ13C值更接近于理論值。

表3 兩種不同方法測定的甲醇δ13C值的獨立樣本T檢驗Table 3 Independent-samples T test onδ13C values of the methanol by the two different determination methods

為了分析離線測定的甲醇結晶體δ13C值和GC-C-IRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值哪個更接近于理論值，對兩者校正后的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值的誤差進行比較，示于圖2。由圖2可知，誤差2小于誤差3，表明離線測定的甲醇結晶體δ13C值更接近于理論值。并且由表1顯示，離線測定的甲醇結晶體δ13C 值標準偏差（0.086‰，n＝5）小于 GC-CIRMS頂空測定的甲醇的δ13C值標準偏差（0.185‰，n＝5），說明離線測定甲醇結晶體δ13C值的方法重現性優于GC-C-IRMS頂空進樣測定。因此，離線測定甲醇結晶體δ13C值優于其他兩種方法，是一種相對可靠的測定甲醇碳同位素值的方法。

圖2 誤差2和誤差3的比較Fig.2 Comparisons between error two and error three

3 結論

通過分析3種不同方法測定的甲醇δ13C值，將其分別對離線測定的甲酯化后的脂肪酸甲酯δ13C值進行校正，并將計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值進行誤差分析，可以得到以下結論：

1）離線測定的甲醇結晶體δ13C值和GC-CIRMS頂空進樣測定的甲醇δ13C值對脂肪酸甲酯校正后，計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的 脂 肪 酸δ13C 值 誤 差 較 小 （0.04‰ ～0.18‰），且幾乎相等，而用離線測定的甲醇鈉固體δ13C值計算得到的脂肪酸δ13C值與離線測定的脂肪酸δ13C值誤差較大（0.12‰～0.25‰）。

2）離線測定的甲醇結晶體δ13C值最接近于理論值，并且此方法測定的甲醇δ13C值標準偏差為0.086‰（n＝5），重現性優于其他兩種方法。所以，離線測定甲醇結晶體δ13C值是一種相對可靠的測定甲醇碳同位素值的方法，進而提高了校正脂肪酸甲酯碳同位素測定值的精準度。

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Comparative Study on Correction Methods of Carbon Isotope Measured Values of the Fatty Acid Methyl Esters

YAO Yuan1，2，ZHAO Jiang-tao2，CAO Yun-ning2，WANG Zheng2，LIU Wei-guo1，2
（1.School of Human Settlement and Civil Engineering，Xi’an Jiaotong University，Xi’an710049，China；2.State Key Laboratory of Loess and Quaternary Geology，Institute of Earth Environment，Chinese Academy of Sciences，Xi’an710075，China）

Methyl esterification of fatty acids is required prior to gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry（GC-C-IRMS）analysis，but each fatty acid methyl ester（FAME）contains a methyl group from derivatization that is not present in the original fatty acid.So it is necessary to correct theδ13C value of each FAME for theδ13C value of the extra methyl carbon.In order to obtain the accurateδ13C value of the methanol used to methylate the fatty acids，and then improve the accuracy of the correctedδ13C values of fat-ty acids，this paper analyse theδ13C values of the methanol as determined by three different methods：1）Theδ13C values of sodium methoxide solid from chemical reaction between the methanol and sodium are determined by off-line method；2）Theδ13C values of methanol crystal as prepared by a special method that liquid nitrogen cools down quartz tube are determined by off-line method；3）Theδ13C values of the methanol are determined by GC-CIRMS with headspace sampling.Besides，theδ13C values of the fatty acids and FAMEs are also determined by off-line method，and theδ13C values of the methanol as determined by three different methods correct theδ13C values of each FAME respectively，and then this paper compare the calculatedδ13C values of the fatty acids with that of the fatty acids as determined by off-line method.The results show that the averageδ13C value of the methanol crystals as determined by off-line method is －50.17‰，and the standard deviation is 0.086‰（n＝5）.Reproducibility of these values is the best，and the calculatedδ13C values that theδ13C values of the FAMEs are corrected by theδ13C values of the methanol are the most similar with theδ13C values of the fatty acids as determined by off-line method.So it is a reliable method that methanol crystals are determined by off-line method，and then its accuracy is improved that theδ13C value of the methanol correct carbon isotope measured values of FAMEs.

fatty acid methyl ester（FAME）；methanol；carbon isotope；correction methods

O 657.63

A

1004-2997（2012）06-0334-08

2012-07-12；

2012-10-16

國家自然科學基金項目（40873011）資助

姚 遠（1986～），男，陜西人，碩士研究生，環境工程專業。E-mail：yaoyuan＿1212＠126.com

劉衛國（1958～），男，陜西人，研究員，從事穩定同位素地球化學研究。E-mail：liuwg＠loess.llqg.ac.cn