紅花中色素類化合物的電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜研究

宗曉菲，張慧榮，李 博，李 麗

（長春師范學(xué)院中心實驗室，吉林 長春 130032）

紅花中色素類化合物的電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜研究

宗曉菲，張慧榮，李 博，李 麗

（長春師范學(xué)院中心實驗室，吉林 長春 130032）

利用電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究了紅花提取物中4種色素類成分，即紅花紅色素、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A和紅花黃色素B。通過多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，獲得4種化合物的分子離子峰，并由此獲得分子質(zhì)量信息；根據(jù)一些特征中性碎片的丟失，提出了紅花中4種色素類成分的質(zhì)譜碎裂規(guī)律。根據(jù)得到的分子質(zhì)量和碎片信息，并與文獻(xiàn)中的已知化合物比較，建立了紅花中色素類化合物的快速分析、質(zhì)譜鑒定的方法。

紅花；色素類化合物；電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MSn）

紅花為菊科雙子葉植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥管狀花，又名草紅、刺紅花、杜紅花或金紅花，我國主產(chǎn)于新疆、河南、湖北、四川、云南，浙江等地［1］。紅花是多種活血化瘀方劑的君藥，對婦科疾病有較好的療效。紅花活血的有效成分主要為紅花色素。紅花色素可分離成黃色素和紅色素兩大類，其中黃色素含量約為4%～10%，紅色素約為0.2%～0.5%［2－4］。

近年來，針對紅花中色素類成分的分析研究主 要為 高 效 液 相 色 譜 法［2－10］。 趙 明 波 等［5］采 用高效液相色譜法定量分析26種不同產(chǎn)地和購買地紅花中羥基紅花黃色素A的含量，結(jié)果表明不同來源的紅花中羥基紅花黃色素A的含量差異較大。大量研究證明［11－15］，電噴霧質(zhì)譜技術(shù)是一種快速有效的分析、鑒定中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分的方法，但有關(guān)紅花這4種色素類化合物電噴霧質(zhì)譜的研究還未見報道。

本工作采用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)研究紅花中4種色素類成分：紅花紅色素、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A和紅花黃色素B，其結(jié)構(gòu)式示于圖1，并提出了4種成分在電噴霧負(fù)離子條件下可能的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，對進(jìn)一步研究其藥理藥效有重要的意義。

圖1 紅花中4種色素類成分的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of the pigments 1—4of the Carthamustinctorius L.

1 實驗部分

1.1 儀器及實驗條件

采用Finngan LCQ電噴霧離子阱質(zhì)譜（MAT，San Jose，CA，USA）。質(zhì)譜分析條件：質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000，實驗前質(zhì)量數(shù)經(jīng)過校正；負(fù)離子模式；樣品通過流動注射泵進(jìn)樣，流速5μL/min；噴霧電壓4kV；毛細(xì)管溫度200℃；鞘氣為氮氣；碰撞氣為氦氣；碰撞誘導(dǎo)解離（CID）的碰撞能量為20%～35%。

1.2 試劑與材料

所用試劑均為分析純：北京化工廠產(chǎn)品；紅花（CarthamustinctoriusL.）藥材：購于北京同仁堂藥店（長春汽車廠分店）。

1.3 樣品制備

稱取2g紅花藥材粉末，用50mL 75%乙醇于室溫下超聲提取3次，每次提取1h。將75%乙醇提取液過濾，合并濾液。減壓蒸餾回收乙醇溶液，蒸干，再用50mL蒸餾水溶解（水溶液）。將水溶液部分用石油醚脫脂3次，每次50mL，棄去石油醚溶液，水溶液部分再用乙酸乙酯萃取5次，每次50mL，合并乙酸乙酯層，減壓蒸餾回收至干（＜60℃），殘渣用5mL 75%乙醇溶解，得樣品溶液，待電噴霧質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

紅花中色素類成分在負(fù)離子條件下的豐度較大，主要出現(xiàn)［M－H］-離子峰，分子質(zhì)量分別為m/z909，611，594，1 043。 通 過 文 獻(xiàn)［2－4，16－17］對比，初步推斷紅花中4種色素類成分分別為紅花紅色素、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A以及紅花黃色素B，且具有類似的結(jié)構(gòu)式。

為了進(jìn)一步驗證這些化合物的分子結(jié)構(gòu)，本研究進(jìn)行了電噴霧質(zhì)譜的多級串聯(lián)實驗，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碰撞能量為20%～35%，得到相應(yīng)化合物的碎片信息，實驗數(shù)據(jù)列于表1。采用Ma等［15－16］研究黃酮類化合物提出的命名規(guī)則，分別以i，jA和i，jB代表A環(huán)或B環(huán)的特征碎片離子，其中上角標(biāo)i和j分別代表C環(huán)鍵斷裂的位置，苯環(huán)上連接的六碳糖用i，j6X 代表［18］。

表1 化合物1～4的電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 The ESI-MSn data in the negative ion mode（m/z values）of compounds 1-4

本實驗首先對化合物1，m/z909離子進(jìn)行多級串聯(lián)質(zhì)譜研究，其數(shù)據(jù)列于表1。在負(fù)離子條件下，化合物1的分子離子峰為［M－H］-（m/z909），因此可以確定化合物1的相對分子質(zhì)量為910。通過與文獻(xiàn)［19］對比，與紅花紅色素的相對分子質(zhì)量一致。在二級串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z909生成了8個離子，分別為m/z891，865，747，707，684，616，603和449，其碎裂路徑推測示于圖2。m/z909離子失去一個質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水）后，生成［M－18－H］-（m/z891）的離子；m/z909離子失去一個質(zhì)量數(shù)為44的中性碎片（CO2）后，生成［M－44－H］-（m/z865）的離子；m/z747是由分子離子峰m/z909丟失一分子葡萄糖形成的；m/z909同時丟失一分子六碳糖基（162）和一分子CO2（44）的中性碎片，生成m/z707碎片離子；m/z684是由母離子上的六碳糖發(fā)生0，36X ［M－90－H］- 和1，56X［M－134－2］-碎裂形成；m/z616是m/z909發(fā)生碎裂形成（［M－293－H］-）；m/z909丟失兩分子的［B-ring］（93），伴隨著六碳糖發(fā)生0，26X碎裂，產(chǎn)生了m/z603碎片離子（［M－93－93－120－H］-）；而m/z449則是m/z909發(fā)生單鍵斷裂產(chǎn)生（［M－460－H］-）。選取基峰m/z891做進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜研究。在ESI-MS3譜，低能CID條件下，m/z891離子進(jìn)一步發(fā)生碎裂產(chǎn)生m/z685和598等碎片離子峰。m/z891丟失中性碎片CO2（44）和一分子六碳糖（162），生成了碎片離子m/z685；m/z598是m/z891丟失碎片離子m/z293形成的。通過以上分析進(jìn)一步確定化合物1為紅花紅色素。

圖2 紅花紅色素碎裂路徑推測Fig.2 Nomenclature adopted for various retro-cydization fragments observed in this study：Carthamus red

化合物2的分子離子峰為［M－H］-（m/z611），多級串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。因此可以確定化合物2的相對分子質(zhì)量為612，通過與文獻(xiàn)［4，19］對比，與羥基紅花黃色素 A 的相對分子質(zhì)量一致。色譜峰2的準(zhǔn)分子離子［M－H］-（m/z611）形成8個主要的分子離子峰，分別為m/z521，491，473，403，385，325，313 和 283。m/z611存在4種主要特征碎裂方式，即和0，3B。分子離子峰m/z611分別發(fā)生06，3X （［M－90－H］- ）和06，2X （［M－120－H］-）碎裂，形成了碎裂離子m/z521，491；m/z611 失去一分子水，同時發(fā)生06，2X 碎裂，形成碎片離子m/z473（［M－120－18－H］-）。m/z611發(fā)生06，3X 和0，3B斷裂，同時丟失一個質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水），生成m/z403（［M－90－118－H］-）離子。m/z385是因為m/z611丟失一分子水（質(zhì)量數(shù)為18），和0，3B 而 生 成。m/z611 發(fā) 生碎裂，并丟失一個質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水），生成m/z325離子。m/z611同時丟失兩分子的06，3X和一分子的0，3B基團，生成m/z313碎片離子。m/z611發(fā)生，0，3B，和碎裂產(chǎn)生了m/z283（［M－90－118－120－H］-）離子。在三級串聯(lián)質(zhì)譜實驗中，形成兩個主要的分子離子峰，分別為m/z473和283。m/z491丟失一個質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水）產(chǎn)生m/z473離子；發(fā)生06，3X 和0，3B碎裂產(chǎn)生m/z283［M－118－90－H］-碎片離子。在四級串聯(lián)質(zhì)譜實驗中，可以觀察到m/z455，413，364，353，341，323，305和235等8個主要的分子離子峰。此化合物有幾個典型 碎 裂 方 式，即 六 碳 糖 的 0，3 （06，3X），0，2（），0，4（）等鍵，發(fā)生斷 裂 會產(chǎn)生［M－H－90］-，［M－H－120］-和［M－H－60］-碎片離子。通過以上分析進(jìn)一步確定化合物2為羥基紅花黃色素A。

化合物3的分子離子峰為［M－H］-（m/z593），多級串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。化合物3的串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖3。因此可以確定化合物3的相對分子質(zhì)量為594，通過與文獻(xiàn)［19］對比，與紅花黃色素A的相對分子質(zhì)量一致。在二級串聯(lián)質(zhì)譜中，母離子峰m/z593丟失2個六碳糖后產(chǎn)生一個碎片離子m/z285。在三級串聯(lián)質(zhì)譜，低能CID條件下，m/z891離子進(jìn)一步發(fā)生碎裂產(chǎn)生m/z267，257，239，229，213，197，195和163等碎片離子峰。m/z285丟失中性碎片一分子水或一分子CO，分別形成m/z267，257離子；而同時丟失一分子水和一分子CO，則形成m/z239離子；同時丟失一分子CO2和一分子CO，形成m/z213離子；同時丟失兩分子的CO2，形成m/z197碎片離子；同時丟失一分子CO2，CO和 H2O，則形成m/z195碎片離子；m/z163是由m/z285發(fā)生0，2B斷裂生成。在低能CID條件下，m/z257離子進(jìn)一步發(fā)生碎裂產(chǎn)生m/z213，229等碎片離子峰，m/z257丟失質(zhì)量數(shù)為44的中性碎片（CO2）或質(zhì)量數(shù)為28的中性碎片（CO），分別生成m/z213和229的碎片離子峰。通過以上分析進(jìn)一步確定化合物3為紅花黃色素A。

圖3 化合物3（m/z 593）串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 The full scan ESI mass spectrum and ESI-MSn of compound 3（m/z 593）in the negative mode

在負(fù)離子模式下，化合物4的分子離子峰為m/z1 043，因此可以確定化合物4的相對分子質(zhì)量為1 044，通過與文獻(xiàn)［20］對比，與脫水紅花黃色素B的相對分子質(zhì)量一致，它是由紅花黃色素B脫去一分子水得到［4］，多級串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。色譜峰4的準(zhǔn)分子離子［M－H］-（m/z1 043）形成5個主要的分子離子峰，分別為m/z1 025，923，853，593和449。m/z1 025是由m/z1 043丟失一個質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水）形成的碎片離子；m/z1 043發(fā)生碎裂形成了m/z923離子；m/z1 043同時丟失一分子CO（28）和一分子六碳糖（162）生成了m/z853離子；當(dāng)連接在六碳糖端位碳上的基團C21H22O11斷裂后，形成m/z593離子；連接在六碳糖端位碳上的另一個基團C27H32O16斷裂后，形成m/z 449碎片離子。選取基峰m/z 1 025做進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜研究。在ESI-MS3譜中，低能CID條件下，m/z 1 025離子進(jìn)一步發(fā)生碎裂產(chǎn)生 m/z 1 007，905，863，773和617等碎片離子峰。m/z1 025丟失質(zhì)量數(shù)為18的中性碎片（一分子水）生成了m/z 1 077碎片離子；六碳糖0位與2位鍵發(fā)生斷裂（），生成了m/z905碎片離子；丟失質(zhì)量數(shù)為162的中性碎片（一分子六碳糖），生成m/z 863碎片離子；丟失碎片，生成m/z 773碎片離子；同時發(fā)生碎片，丟失一個質(zhì)量數(shù)為162中性碎片（一分子六碳糖）及兩分子水，形成了m/z617碎片離子。該斷裂規(guī)律符合脫水紅花黃色素B的結(jié)構(gòu)特點，進(jìn)一步確定化合物4為脫水紅花黃色素B。

實驗結(jié)果表明：通過電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，可以獲得紅花粗提物中相應(yīng)化合物的相對分子質(zhì)量信息，結(jié)合源內(nèi)CID技術(shù)，通過一些中性碎片的丟失，以及一些典型碎裂路徑，推斷出化合物的結(jié)構(gòu)。雖然不是化合物結(jié)構(gòu)的最終確定，但卻是植物粗提物化合物結(jié)構(gòu)快速分析的簡單有效方法。

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Study on Pigments in Plant Extracts from Carthamus tinctorius L.by ESI-MSn

ZONG Xiao-fei，ZHANG Hui-rong，LI Bo，LI Li
（The Central Laboratory，Changchun Normal University，Changchun130032，China）

The structures of four pigments in plant extract ofCarthamustinctoriusL.were analyzed and identified by electro-spray ionization multistage mass spectrometry（ESI-MSn）in the negative mode.The identification of the pigments in plant extract ofC.tinctoriuswas based on the comparison of molecular ions and the fragment ions obtained by ESI-MSnexperiments with the data was reported in the literatures.The characteristic ESI-MSnfragmentation pattern of the four pigments was discussed，and found to be a specific and useful tool for the structural identification of pigments from this plant.

CarthamustinctoriusL.；pigment；electro-spray ionization multistage mass spectrometry（ESI-MSn）

O 657.63

A

1004-2997（2012）06-0357-06

2012-07-06；

2012-10-08

國家自然科學(xué)基金（30970299），吉林省科技廳項目（200905109，20090936），吉林省教育廳項目（2011-187）資助

宗曉菲（1988～），女，吉林洮南人，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：zongxiaofei＠hotmail.com

李 麗（1969～），女，吉林公主嶺人，教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。