錨蛋白重復序列3基因在早發性精神分裂癥發生過程中的作用☆

袁愛花 易正輝 孫錦華 杜亞松 張晨 李則摯 張燕霞汪東祥 劉漪 范娟 禹順英

錨蛋白重復序列3基因在早發性精神分裂癥發生過程中的作用☆

袁愛花*易正輝*孫錦華*杜亞松*張晨*李則摯*張燕霞*汪東祥*劉漪*范娟*禹順英*

目的 探討錨蛋白重復序列3（Ankyrin repeat 3，ANK3）基因在早發性精神分裂癥發生過程中的作用。方法 采用TaqMan探針等位基因分型技術檢測310例早發性精神分裂癥患者和399例健康對照ANK3基因rs10761482位點多態性，分析該位點與早發性精神分裂癥的關聯及其與發病年齡的關系，并調查患者母親懷孕早期的環境因素，進一步分析ANK3基因與環境因素的交互作用。 結果 患者組與對照組ANK3基因rs10761482位點的基因型頻率組間差異無統計學意義 （χ2＝5.410，P＝0.067），而患者組 rs10761482 C等位基因頻率高于對照組，有統計學意義（83.06%vs.78.07%，P ＝ 0.019）；攜帶 rs10761482 C 等位基因患者發病年齡（13.7 ± 0.1歲）明顯早于不攜帶 C 等位基因患者發病年齡（16.1 ± 0.3 歲）（P ＝ 0.028）； 未發現 ANK3基因與環境因素間之間存在交互作用（P＞0.05）。 結論 ANK3基因與早發性精神分裂癥存在關聯，其rs10761482多態位點可能是導致患者發病年齡提前的重要因素。

早發性精神分裂癥 錨蛋白重復序列3基因 發病年齡 交互作用

神經發育假說是精神分裂癥發病機制中的一種重要假說［1－2］。 錨蛋白重復序列 3（Ankyrin repeat 3，ANK3）基因定位于 10q21， 其編碼的 ankyrin-G蛋白參與了神經元的發育過程［3］。全基因組關聯分析顯示，ANK3基因多態性位點rs10761482與精神分裂癥存在關聯［4］。而最近一項研究表明，該位點在人群中降低對精神分裂癥發生的易感性［5］，早發性精神分裂癥（18周歲之前發病）較成年期起病的精神分裂癥存在更多的遺傳負荷［7－8］。除遺傳因素外，環境因素在精神分裂癥發生中可能起重要作用，如早發性精神分裂癥患者較其未患病同胞有更多的環境危險因素暴露情況［6］。因此，本研究選擇早發精神分裂癥性為研究對象，首先評價ANK3基因rs10761482位點與其發生是否存在關聯，然后分析該位點對其發病年齡的影響，并從基因和環境交互作用角度進一步探討ANK3基因在早發性精神分裂癥發生過程中的作用。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 來自2006年1月至2007年12月于上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心門診和住院治療的早發性精神分裂癥患者。早發性精神分裂癥定義為起病年齡≤18周歲的精神分裂癥。入組標準：①符合美國精神障礙診斷與統計手冊第4版（diagnostic and statisticalmanual ofmental disorders，4th revision，DSM-Ⅳ）精神分裂癥診斷標準；②漢族；③征得患者本人或其監護人對本研究的知情同意。排除標準：①精神分裂癥外的軸I障礙；②嚴重軀體疾病。共入組患者310例，其中男202例，女 108例，年齡為 10～ 42歲，平均（19.4±7.6）歲，起病年齡為 7～ 18 歲，平均（14.5 ± 3.7）歲。

對照組均來自健康體檢者，無精神疾病及重大軀體疾病史。共399名，其中男269例，女130例，平均（34.1 ± 5.7）歲，

1.2 環境因素調查 采用自編調查問卷，調查患者母親孕早期有無感染史，有無營養不良史、有無放射線暴露史以及父母生育年齡等四項數據。

1.3 基因組DNA提取 采集患者及健康對照者靜脈血各2 mL，EDTA抗凝，分離白細胞，采用基因組DNA試劑盒（北京天根生物有限公司）提取基因組DNA，并于－20℃條件下保存備用。

1.4 基因分型 采用TaqMan探針SNP基因分型技術對rs10761482位點進行分型：引物和探針由美國應用生物系統公司定制，PCR反應試劑Taq-Man Universal PCR MasterMix由ABI公司提供。PCR 反應體系：10 ng DNA 模板，2.5μL 2× Taq-Man PCRMasterMix，0.25 μL 20 × SNPAssay。 反應條件：95℃ 10min，（92℃ 15s，60℃ 1 min） × 40；反應在ABI7900熒光定量PCR儀的384孔板中進行，以SDS 2.0圖像分析軟件分析不同等位基因所標的FAM和VIC熒光強度，判斷待測樣本為純合子或雜合子。對未檢出基因型的DNA樣本進行一次重復分型，最終未檢出基因型的DNA樣本基因型記為“0”。

1.5 統計學方法 采用 UNPHASED 3.10遺傳分析軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及單個位點遺傳關聯分析。使用SPSS 18.0軟件通過Kaplan-Meier生存分析方法研究基因位點與發病年齡的關系。根據單純病例研究方法，將患者組按基因型、暴露因素的有無，采用二分類Logistic回歸估計兩者在疾病發生中的相乘模型交互作用，計算比值比 （odd ratio，OR）值及其95%可信區間（confidence interval，CI），探討基因與環境交互作用對疾病發生的影響。檢驗水準α＝0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 Hardy-W einberg遺傳平衡檢驗 本研究共得到304例精神分裂癥患者和399例正常對照者的DNA分型結果，病例組基因型檢出率為98%，對照組基因型檢出率為100%。經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，rs10761482位點基因型分布在患者組與對照組的觀察值和預期值之間差異均無統計學意義（χ2＝ 0.013，P ＞ 0.05；χ2＝ 0.281，P ＞ 0.05），能夠代表各自群體。

2.2 ANK3基因rs10761482位點與早發性精神分裂癥的關聯分析 患者組和正常對照組間rs10761482位點基因型頻率差異無統計學意義（χ2＝ 5.410，P ＝ 0.067）， 而等位基因頻率差異具有統計學意義（χ2＝ 5.474，P ＝ 0.019）。 C 等位基因的疾病 OR 值為 1.377，95%可信區間 （CI） 為 1.051～1.805。 見表 1。

表1 患者組與對照組ANK3基因rs10761482位點基因型及等位基因分布比較 n（%）

2.3 rs10761482位點與早發性精神分裂癥發病年齡的關系 Kaplan-Meier生存分析方法Log Rank檢驗法的結果顯示，攜帶rs10761482位點C等位基因的患者發病年齡（13.7 ± 0.1）歲，小于不攜帶C 等位基因患者的發病年齡 （16.1 ± 0.3）歲，發病年齡曲線分布差異有統計學意義 （χ2＝7.051，P＝0.028）。

圖1 rs10761482位點與發病年齡的關系

2.4 ANK3基因與環境因素間的交互作用 由于入組患者母親均未提供其懷孕早期有無放射線暴露史和營養不良史，故以上2項參數最后未進入Logistic回歸方程。本研究結果發現，ANK3基因與父親年齡［OR （95%CI） ＝ 2.41 （0.22～ 17.31），P ＝0.11］， 母 親 年 齡 ［OR （95%CI） ＝ 0.71 （0.14～2.35），P ＝ 0.89］及孕期感染［OR （95%CI ） ＝ 0.23（0.03～ 1.92），P ＝ 0.77］等因素之間的交互作用均無統計學意義。

3 討論

ANK3基因編碼的ankyrin-G蛋白是一種重要的膜調控蛋白，在神經元軸突發育中負責軸突極性包括離子型和代謝型谷氨酸鹽受體在內的發生和形成，而谷氨酸鹽受體異常與精神分裂癥的發生密切相關［9－10］。 本研究結果顯示，ANK3 基因rs10761482位點的C等位基因頻率在患者組和正常對照組間的分布差異有統計學意義，提示該位點與早發性精神分裂癥的發生存在顯著關聯，這與Athanasiu等的全基因組關聯分析研究結果一致［4］。多年來精神分裂癥易感基因關聯研究一直困惑于結果一致性差，因此至今無法定位確切的致病基因。最新一項基于基因表達和功能的研究發現ANK3基因的異常可能參與了精神分裂癥的發生［11］。本研究結果為該基因在精神分裂癥發病過程中的作用提供了進一步的證據。以往證據顯示，早發性精神分裂癥患者相比成年期發病患者存在更為明顯的大腦結構和功能改變［12］。由此可見，在胚胎的早期發育過程中，rs10761482位點可能影響了ANK3基因的表達或轉錄，進而影響了神經元軸突極性的發生，造成神經發育異常，最終可能與早發性精神分裂癥的發生有關。

最近一項關于早發性精神分裂癥的腦源性神經營養因子（BDNF）分子遺傳學研究顯示，在男性患者中，攜帶該基因的Met等位基因的患者發病年齡較早，提示神經發育相關基因可能影響精神分裂癥的發病年齡［13］。本研究結果顯示，ANK3基因與早發性精神分裂癥的發病年齡有關，攜帶rs10761482位點C等位基因患者的發病年齡顯著早于不攜帶C等位基因患者的發病年齡。可見，攜帶該位點C等位基因的患者可能存在神經軸突發育異常，從而導致發病年齡提前。

rs10761482位于ANK3基因的第1內含子上。內含子與基因功能的關系越來越受到人們的關注。內含子具有多樣性的功能特征，內含子可充當抑制子、增強子，不僅對基因表達起抑制作用，在一些基因的表達過程中也起增強作用［14－15］。此外內含子還可以表達為成熟酶、逆轉錄酶和核酸內切酶，與基因的表達和調控密切相關［16］。因此，ANK3基因的rs10761482位點有可能通過上述機制參與了早發性精神分裂癥的發生。

既往有研究顯示，父母生育年齡、母孕早期感染史、營養不良史及應激史等環境因素與子代精神分裂癥的發生有關［17］，這些提示基因與環境交互作用在精神分裂癥的發生中可能起重要作用。然而，既往研究結果并不一致［18－19］。 鑒于 ANK3 基因的生物學作用主要發生在神經發育階段，因此本研究主要關注患者母孕早期的環境因素。本研究通過Logistic回歸模型發現ANK3基因與環境因素之間不存在交互作用，提示ANK3基因對精神分裂癥的影響可能與環境因素無關。本研究結果與以往［19］研究結果相似，該研究未發現精神分裂癥DNA甲基轉移酶3B基因與環境之間存在交互作用。

本研究存在一定的局限性：①研究樣本含量偏小，限制了本研究的統計效能；②所選擇的環境因素指標不夠全面，且部分樣本是回顧性的，對于孕早期環境因素的確定不可避免有一定的影響，可能對本研究結果有影響。因此，涉及表型和更深入的功能分析大樣本研究，將有助于對與基因多態性相關的精神分裂癥的可能發病機制進行深入探討。

［1］ 郭敬華，郭素芹，蘇林雁，等.腦源性神經營養因子基因C270T多態性與兒童精神分裂癥的關系［J］.中國神經精神疾病雜志， 2009，35（9）：257－260.

［2］Savonenko AV，Melnikova T，Laird FM，et al.Alteration of BACE1-dependent NRG1／ErbB4 signaling and schizophrenialike phenotypes in BACE1-null mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA， 2008，105（14）：5585－5590.

［3］Hedstrom KL，Ogawa Y，Rasband MN.AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity［J］.JCell Biol， 2008，183（4）：635－640.

［4］Athanasiu L，Mattingsdal M，K?hler AK，et al.Gene variants associated with schizophrenia in a Norwegian genome-wide study are replicated in a large European cohort［J］.JPsychiatr Res， 2010，44（12）：748－753.

［5］Gella A，Segura M，Durany N，et al.Is Ankyrin a genetic risk factor for psychiatric phenotypes?[J］ BMC Psychiatry，2011，11：103－120.

［6］Kyriakopoulos M， Frangou S.Pathophysiology of early onset schizophrenia［J］.Int Rev Psychiatry， 2007，19（4）：315－324.

［7］Iwata Y， Matsumoto H， Minabe Y， et al. Early-onset schizophrenia and dopamine-related gene polymorphism［J］.Am JMed Genet B Neuropsychiatr Genet， 2003，116B（1）：23－26.

［8］Kumra S， Charles Schulz S.Editorial： research progress in early-onset schizophrenia ［J］.Schizophr Bull， 2008，34 （1）：15－17.

［9］Sobotzik JM，Sie JM，Politi C，et al.AnkyrinG is required to maintain axo-dendritic polarity in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA， 2009，106 （41）：17564－17569.

［10］蘇允愛，司天梅，周東豐，等.MK-801建立谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2006，32（6）：558－560.

［11］Roussos P，Katsel P，Davis KL，et al.Molecular and Genetic Evidence for Abnormalities in the Nodes of Ranvier in Schizophrenia［J］.Arch Gen Psychiatry， 2012，69（1）：7－15.

［12］Vourdas A， Pipe R， Corrigall R， et al.Increased developmental deviance and premorbid dysfunction in early onset schizophrenia［J］.Schizophr Res， 2003，62（1－2）：13－22.

［13］Yi Z，Zhang C，Wu Z，et al.Lack of effect of brain derived neurotrophic factor （BDNF） Val66Met polymorphism on early onset schizophrenia in Chinese Han population［J］.Brain Res，2011，1417：146－150.

［14］Hertel KJ， Maniatis T.The function ofmultisite splicing enhancers［J］.Mol Cell， 1998，1（3）：449－455.

［15］Howe KJ，Ares M Jr.Intron self-complementarity enforces exon inclusion in a yeast pre-mRNA［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94（23）：12467－12472.

［16］Comeron JM， Kreitman M. The correlation between intron length and recombination in drosophila. Dynamic equilibrium between mutational and selective forces［J］.Genetics， 2000，156（3）：1175－1190.

［17］van Os J， Rutten BP， Poulton R.Gene-environment interactions in schizophrenia： review of epidemiological findings and future directions［J］.Schizophr Bull， 2008，34（6）：1066－1082.

［18］Guilarte TR，Opler M，Pletnikov M.Is lead exposure in early life an environmental risk factor for Schizophrenia？ Neurobiological connections and testable hypotheses［J］.Neurotoxicology， 2012，33（3）：560－574

［19］張晨，方貽儒，謝斌，等.DNA甲基轉移酶3B基因在早發性精神分裂癥發生過程中的作用研究［J］.中華醫學遺傳學雜志， 2010，27（6）：697－699.

Association of ANK3 gene polymorphism with early-onset schizophrenia.

Yuan Aihua， Yi Zhenghui， Sun Jinhua， Du Yasong， Zhang Chen， Li Zezhi， Zhang Yanxia， Wang Dongxiang， Liu Yi， Fan Juan， Yu Shunying.Shanghai Mental Health Center， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， No.600 wanping Road， Shanghai，200030， China.Tel： 021－34289888.

ObjectiveTo investigate the association of ANK3 （Ankyrin repeat 3） gene polymorphism with the development of early-onset schizophrenia.M ethods A single nucleotide polymorphism （rs10761482） of ankyrin repeat 3 （ANK3） gene was genotyped in 310 early-onset schizophrenic patients and 399 healthy controls， using TaqMan SNP Genotyping Assays.The association of the locuswith early-onset schizophrenia and age of onsetwas analyzed.The prenatal information of the patients was collected to detect the interaction between the ANK3 gene and environmental factors.Results There was no statistically significant difference in genotype distribution of the rs10761482 locus between patients and controls （χ2＝ 5.410， P ＝ 0.067）.The frequency of the C allele of this locuswas significantly higher in patients than in controls （83.06%vs 78.07%， P ＝ 0.019）； The C allele was highly associated with an earlier age of onset compared with non-c allele （13.7 ± 0.1 years vs 16.1 ± 0.3 years， P ＝ 0.028）.There was no interaction between the ANK3 gene and environmental factors （P ＞ 0.05）.Conclusions ANK3 gene is associated with early-onset schizophrenia and rs10761482may play an important role in age of onsetof schizophrenia.

Early-onset schizophrenia ANK3 gene age of onset Interaction

（E-mail： yushuny＠yahoo.com）

R749.3

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.008

☆ 國家自然科學基金面上項目（編號：81071094）；上海市衛生局青年項目（編號：2010Y030）；上海交通大學醫工交叉研究基金項目（編號：YG2011MS54）

* 上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心（上海200030）

2011－11－14）

文飛）

·論 著·