腦脊液單核細胞內ESAT-6對結核性腦膜炎的診斷價值☆

楊笑 郭旻 謝鵬

腦脊液單核細胞內ESAT-6對結核性腦膜炎的診斷價值☆

楊笑*郭旻△謝鵬*

目的 通過檢測結核性腦膜炎（tuberculousmeningitis，TBM）患者腦脊液單核細胞中的早期分泌抗原靶蛋白6（early secreted antigenic target，ESAT-6），探討ESAT-6在TBM診斷中的價值。方法 將42例TBM患者與47例對照組患者進行腦脊液生化、細胞學、抗酸染色檢查，同時用免疫熒光細胞化學染色法檢測腦脊液單核細胞內的ESAT-6。結果 在臨床診斷TBM的42例患者中有38例腦脊液單核細胞中檢出ESAT-6，47例對照組中檢出4例。TBM組ESAT-6的檢出率明顯高于對照組（P＜0.05）。該方法診斷TBM的敏感性為90.48%，特異性為91.49%。約登指數達到0.82。結論 檢測腦脊液單核細胞內結核特異性抗原ESAT-6用于診斷TBM，具有靈敏度、特異度高的特點，而且簡單易行，有望成為診斷TBM的一種新的輔助方法。

結核性腦膜炎 腦脊液 早期分泌抗原靶蛋白6

結核性腦膜炎（tuberculousmeningitis，TBM）是結核分枝桿菌引起的腦膜和脊髓膜的非化膿性炎癥性疾病，是中樞神經系統感染的常見類型［1］。TBM具有很高的致死與致殘率，而早期診斷、及時治療是降低病死率、病殘率的關鍵。ESAT-6是從結核分枝桿菌中分離純化出的早期分泌性抗原靶蛋白6，其具有較強的細胞與體液免疫活性，且僅存在于致病性分枝桿菌中，故作為結核菌檢測的靶抗原具有良好的敏感性與特異性。本實驗使用免疫熒光細胞化學染色法對TBM患者腦脊液單核細胞內的ESAT-6進行檢測，試圖為TBM的實驗室診斷提供一種有效的方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 TBM 組 選擇 2007年 3月年至 2011年 2月于寧夏醫科大學附屬醫院神經內科住院的符合下述診斷標準的臨床確診TBM的病例42例，其中男22例，女20例，年齡16～72歲，平均年齡（39.14 ± 19.54）歲 ，入院前均未接受抗結核治療。發病至入院進行正規抗結核治療的天數是7 d～43 d，平均（23.43 ± 12.35） d。 其中單純 TBM23 例，合并顱外結核者19例（陳舊性肺結核10例，血型播散性肺結核5例，脊椎結核2例）。42例行頭顱CT及或MR檢查，35例異常，其中輕度梗阻性腦積水30例，腦腫脹3例，腦梗死1例，腦膜、腦基底池明顯強化的8例。所有病例在臨床確診后即予以正規四聯抗結核治療。TBM的臨床診斷標準參考 Ahuja［2］的臨床診斷標準，包括：①臨床表現有發熱、頭痛、嘔吐，腦膜刺激征或伴有局灶性神經損害；②腦脊液檢查顯示細胞數增加，蛋白升高，糖和氯化物降低，阿利新蘭染色未見隱球菌；③腦CT或MRI檢查存在腦基底池滲出或腦積水或梗死灶等表現；④存在顱外結核如肺結核；⑤抗結核治療有效；⑥除外其他神經科疾病。

1.1.2 對照組 均來自2008年10月至2011年2月寧夏醫科大學附屬醫院神經內科的非TBM顱內感染的住院病例，共47例，男24例，女23例，年齡 17～ 66 歲，平均年齡（36.67 ± 16.67）歲。 其中化膿性腦膜炎25例，設為對照組1，病毒性腦膜炎22例，設為對照組2。非TBM患者診斷標準：參考人民衛生出版社第六版《神經病學》教科書［1］。

1.2 研究方法

1.2.1 腦脊液細胞學檢查 FCSⅣ型微型腦脊液細胞玻片離心沉淀器（ThermoFisher生產），生化檢查及濃縮集菌抗酸染色涂片。

1.2.2 腦脊液細胞制片和保存

1.2.3 ESAT-6免疫熒光細胞化學染色 ①取出玻片梯度復溫；②0.01 M PBS震蕩漂洗3次，每次5 min，晾干；③0.3%tritonX-100 溶液 50 μL 透膜10min，0.01M PBS 震蕩漂洗 3 次，每次 5min，晾干；④玻片上加入10%正常山羊血清100μL封閉，置濕盒內室溫 30 min，0.01 M PBS震蕩漂洗3次，每次5 min，晾干；⑤加入一抗小鼠抗人ESAT-6單克隆抗體 （購自美國Orbigen公司）50μL，稀釋度1∶200，以PBS緩沖液替代一抗為陰性對照，置濕盒內37℃溫箱孵育1 h，4℃過夜，取出后 37℃ 溫箱復溫 30min，0.01 M PBS震蕩漂洗3次，每次 5 min，晾干；（以下所有步驟都避光）；⑥加入熒光二抗FITC-兔抗鼠多克隆抗體（購自美國 Orbigen 公司）50 μL，稀釋度為 1∶40，置濕盒內37℃溫箱孵育 1 h，0.01M PBS 震蕩漂洗 3 次，每次5min，晾干；⑦玻片上加入10%正常山羊血清100 μL 封閉，置濕盒內室溫 30min，0.01M PBS 震蕩漂洗3次，每次5min，晾干；⑧立即用95%甘油封片待檢。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察 腦脊液圖文分析儀（MCDS-2020重慶）采圖判讀結果，單核細胞胞漿呈綠色熒光為陽性，單核細胞胞漿呈暗淡淺綠為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0進行統計學分析，各項檢測結果以±s記錄。率的比較用χ2檢驗，檢驗水準 α ＝ 0.05。

2 結果

2.1 腦脊液細胞學結果

TBM組細胞學全部呈混合細胞反應，對照組1多呈以中性粒細胞為主的混合細胞反應，兩者細胞比例差異有統計學意義，P＜0.05。對照組2則以淋巴細胞反應為主，并與TBM組及對照組1差異有統計學意義，P ＜ 0.05（見表 1）。

2.2 腦脊液生化結果

TBM組與對照組1中蛋白均明顯升高，二者無統計學差異，而對照組2僅輕度升高。TBM與對照組1中糖、氯化物均降低，TBM組降低更明顯，但二者比較無統計學差異。對照組2糖與氯化物均在正常范圍（見表2）。

表1 腦脊液細胞學結果

表2 腦脊液生化結果

2.3 腦脊液抗酸染色結果 42例TBM患者抗酸染色陽性的有6例。對照組1與對照組2均陰性。

2.4 單核細胞內ESAT-6熒光免疫染色檢測結果

TBM組42例中有38例單核細胞內的ESAT-6呈現陽性（見圖1、表3），包括治療前與治療后的TBM患者。對照組1中例有4例檢測陽性。對照組2全部陰性（見圖2）。

表3 ESAT-6檢測結果

圖1 ESAT-6陽性染色的腦脊液單核細胞圖2 ESAT-6陰性染色的腦脊液單核細胞與淋巴細胞

3 討論

TBM是嚴重的肺外結核病，因為在臨床表現、腦脊液及影像學檢查等方面無明顯特異性表現，故而一直以來早期診斷困難，使患者往往貽誤治療時機，導致較高的病死率、致殘率［3－4］。文獻報道，TBM 的誤診率高達 50.73%［5］。

結 核 分 枝 桿 菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB）是胞內寄生菌，機體受到MTB感染后，其首先被單核巨噬細胞吞噬，故而單核巨噬細胞內的結核抗原檢測可以作為MTB存在的直接證據。ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是從MTB短期培養濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白，在感染的單核細胞內生長時，ESAT-6蛋白表達明顯提高［6］，因此檢測單核細胞內ESAT-6具有更好的敏感性。ESAT-6僅存在于致病性分枝桿菌中，而BCG及其他非致病性分枝桿菌缺失［7］，因此，檢測ESAT-6不會因為卡介苗接種和環境中的非致病性分枝桿菌感染而出現假陽性，具有較高的特異性。何俊瑛等［8］用免疫組織化學法對TBM患者進行了腦脊液單核細胞內ESAT-6的檢測，發現其靈敏度為70%而特異度達到95%。

本實驗中TBM組42例患者38例腦脊液單核細胞內ESAT-6檢測呈陽性反應，其中9例持續檢測，此9例中有6例于治療前呈陽性反應，正規四聯抗結核治療1個月后轉陰，說明早期檢測及治療前檢測陽性率更高，因為隨著治療的進展，單核細胞內結核桿菌被殺滅、降解，細胞染色亦轉陰，而另外3例則治療2月后仍持續陽性，3例TBM患者臨床亦表現為病情重，病程遷延，顯示一定的耐藥性，提示腦脊液單核細胞內結核抗原的檢測具有一定判斷療效及轉歸的作用。TBM組有4例呈陰性反應，考慮可能與單核細胞比例較少及抗原量少有一定的關系。通常認為結核桿菌為胞內寄生菌，進入腦脊液中即被單核細胞吞噬，理論上不應有單核細胞外的其它細胞染色，但本實驗中TBM組患者腦脊液除單核細胞強染色外，淋巴細胞及中性粒細胞均有輕度染色，考慮可能與淋巴細胞、中性粒細胞在疾病發展中尤其是疾病早期較弱的吞噬作用有關。對照組1的25例中有4例呈陽性染色，治療后1周復查3例轉陰，1例仍呈陽性，此4例均否認結核病史，經抗細菌感染治療后病情迅速穩定好轉，其單核細胞內ESAT-6染色陽性考慮可能與MTB與屬內外某些微生物有共同的抗原故而發生交叉免疫。對照組2中22例全部陰性，提示腦脊液單核細胞內ESAT-6具有較好的特異性。此方法診斷TBM 敏感性為90.48%，特異性為91.49%。

總之，本實驗利用結核分枝桿菌胞內寄生的特點，運用免疫熒光細胞化學染色法對TBM及非TBM顱內感染患者腦脊液單核細胞內ESAT-6進行檢測，結果顯示其具有較高的敏感性與特異性，對于TBM的診斷具有一定的價值。

TBM組與對照組1在腦脊液白細胞總數、細胞比例方面雖存在統計學差異，但數據重疊較多，臨床無法依此鑒別兩者。而葡萄糖、氯離子、蛋白水平等方面均無統計學差異，此兩組指標與對照組2分別比較均有統計學差異。說明依靠腦脊液細胞學及生化檢查較易區別細菌性和病毒性顱內感染，但難以鑒別TBM與非特異性細菌感染。本實驗中腦脊液涂片抗酸染色檢查顯示了較低的敏感性，提示其不能很好地滿足臨床需要。

［1］ 賈建平，崔麗英，王偉，等.神經病學（第六版）［M］.北京：人民衛生出版社， 2010：240－242.

［2］Ahuja GK， Mohan KK， Prasad K， et al.Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation［J］.Tuber Lung Dis， 1994，75（2）：149－152.

［3］ 武俊平，吳琦.結核性腦膜炎診斷與治療研究進展［J］.國外醫學呼吸系統分冊， 2005，25（1）：49－51.

［4］ 豐巖清，國寧.不典型的結核性腦膜腦炎［J］.中國神經精神疾病雜志， 2009，32（5）：479－483.

［5］ 李玲，尤志君，黃如訓，等.中樞神經系統結核誤診分析［J］.中國神經精神疾病雜志， 2001，27（3）：189－192.

［6］Lee BY， Horwitz MA.Identification of macrophage and stressinduced proteins of Mycobacterium tuberculosis［J］.Clin Invest， 1995，96（1）：245－249.

［7］Arend SM， deHaas P， Leyten E， et al.ESAT-6 and CFP-10 inclinical versus environmental isolates of Mycobacterium kansasii［J］.InfectDis， 2005，191（8）：1301－1310.

［8］ 何俊瑛，劉士甫.腦脊液單核細胞內ESAT-6檢測對結核性腦膜炎的診斷意義［J］.腦與神經疾病雜志， 2010，18（3）：209－211.

The value of ESAT-6 in themonocytes of CSF in diagnosis of tuberculousmeningitis.YANG Xiao， GUOMin，XIEPeng.Neurology Research Center of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China.Tel： 023－68485490.

ObjectiveEvaluate the value of ESAT-6 in diagnosis of tubercularmeningitis by detecting ESAT-6 in the monocytes of CSF.M ethods 42 patients with tuberculous meningitis were chosen as TBM group and 47 patients with non-tuberculous intracranial infections as control group.All patients in both groups had routine biochemical test， cytology examination （May-Grunwald Giemsa stain） and acid fast stain tests， while immunofluorescence cytochemical staining was used to detect ESAT-6 in the monocytes of CSF. Results In TBM group， 38 patients showed positive ESAT-6 in themonocytes of CSF， while only 4 showed positive ESAT-6 in the control group.The positive rate of ESAT-6 in TBM group was significantly higher than that in the control group （P ＜ 0.05）， its sensitivity was 90.48%， and specificity was 91.49%.Youden index is 0.82.Conclusions The ESAT-6 detection， with high sensitivity and specificity， is a simple and feasiblemethod in diagnosis of tuberculousmeningitis.

Tuberculous meningitis （TBM） Cerebrospinal fluid （CSF） Early secreted antigenic target（ESAT-6）

R529.3

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.003

☆ 寧夏自然科學基金項目（編號：NZ10150）

* 重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶醫科大學神經科學研究中心（重慶 400016）

△ 寧夏醫科大學第二附屬醫院

（E-mail：xiepeng58＠21cn.com）

2011－07－16）

李立）

·論 著·