人腦膠質瘤中IKKε的表達及其意義

李會兵 俞凱 張安玲 王坤 王廣秀 康春生 黃強

人腦膠質瘤中IKKε的表達及其意義

李會兵*俞凱*張安玲*王坤*王廣秀*康春生*黃強*

目的 探討IKKε基因在人腦膠質瘤組織中的表達及其意義。方法 收集具有明確病理分級的51新鮮膠質瘤標本，其中Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤24例，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤27例，并取7例內減壓去除的腦組織標本作為對照。采用實時定量PCR（Real-time PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測IKKεmRNA和蛋白水平的表達，免疫組化染色確定IKKε的細胞定位，研究IKKε蛋白表達與膠質瘤病理分級的關系。結果 IKKε mRNA 水平（t＝ 23.734，P＜ 0.05）和蛋白水平（χ2＝ 12.583，P＜ 0.05）在人膠質瘤中的表達顯著高于對照腦組織，在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組的表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ級組（t＝21.587，P＜0.05）。Western blot結果顯示7例對照腦組織6例無IKKε表達 （6／7），24例Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤3例中／高表達，27例Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤23例中／高表達。IKKε的表達與人腦膠質瘤病理分級呈正相關（r＝0.513，P＜0.05）。免疫組化染色顯示IKKε陽性反應物主要位于胞漿。結論 IKKε在人腦膠質瘤中呈高表達，IKKε的表達與人腦膠質瘤的病理分級相關，可能與人腦膠質瘤的發生及惡性進展有關。

人腦膠質瘤 IKKε病理分級

盡管近年來對膠質瘤的治療有了很大進展， 但近二十年來惡性膠質瘤患者預后仍無明顯改善。IKKε基因作為先天免疫反應和炎癥反應的調節者分別調控干擾素和NF-κB通路，近年來被證實出現在腫瘤的惡性轉化過程中［1］。本實驗通過免疫組化方法，Real-time PCR和 Western blot檢測IKKε基因在不同級別膠質瘤組織和對照腦組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例來自環湖醫院2010年9月至2011年6月經手術及病理證實，且病理與臨床資料完整的膠質瘤患者，共51例，其中男28例，女23例，年齡32～81歲。病程3個月至18個月，所有患者術前未行放化療。另收集7例腦外傷行內減壓的腦組織作為對照組。按照《WHO中樞神經系統腫瘤組織學分類》（2007）標準分級［2］，Ⅰ級5例全部為毛細胞型星形細胞瘤；Ⅱ級19例，包括原漿型星形細胞瘤7例、纖維型星形細胞瘤4例、少枝膠質細胞瘤8例；Ⅲ級15例，包括間變性星形細胞瘤9例，6例間變性少實膠質細胞瘤；Ⅳ級12例均為膠質母細胞瘤。每份樣本都分為兩份，一份經10%福爾馬林固定后作免疫組織化學檢測，另一份經液氮速凍后儲存－80℃，用于提取RNA和蛋白質。主要試劑：Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉錄及PCR試劑盒及引物（TaKaRa公司），RIPA裂解液及超敏發光液（普利萊公司），ABC試劑盒（Vector公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉生物工程公司），兔抗人IKKε抗體（Sigma公司），鼠抗人GAPDH抗體（北京中杉生物工程公司）。

1.2 免疫組化染色檢測IKKε表達量 石蠟切片脫蠟脫水，置于3%H2O2溶液中室溫孵育30min后，置于抗原修復液中97℃微波修復1 h，1%胎牛血清室溫封閉20min，吸去封閉液后滴加稀釋好的一抗（1∶100），陰性對照用PBS分別代替一抗作為空白對照，置于濕盒內， 4℃過夜，次日PBS洗5 min，3次，滴加生物素標記羊抗兔二抗工作液，37℃孵育1 h，PBS洗5min，3次，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育1 h，DAB顯色1～3min后進行蘇木精復染，鹽酸分化，脫水，透明，樹膠封片。使用OLYMUS圖像采集系統照相。每張玻片在高倍鏡（×200）下隨機選取5個視野，每視野計數200個細胞， 陽性分級標準為：陽性細胞率在0～10%為（－）；11%～ 40% 為低表達（＋）；41%～ 75%為中表達（＋＋）； ＞ 76%為高表達（＋＋＋）。

1.3 Real-time PCR檢測IKKεmRNA的表達Trizol提取總RNA，Nanodrop儀測RNA純度，取2μg總RNA逆轉錄為cDNA，進行Real-time PCR擴增，以β-actin為參照。擴增體系 20μL：realtime sybgreen 9 μL，special primer set 1 μL，ddH2O 9μL，cDNA 1μL。反應條件：預變性 95℃，10min，之后每一步變性 95℃，15 s，退火 60℃，1min，延伸60℃，1min，以上步驟循環40次，最后72℃繼續延伸 5 min。 IKKε上游引物 5′-GGAGTGCGTGCAGAAGTATCAA-3′， 下 游 引 物 5′-CAGCCACAG AACAGCCAACC-3′，β-actin 上 游 引 物 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物 5′-GCTGTCACCTTC ACCGTT-3′。Real-time PCR結果判定：ΔCT ＝ CTIKKε-CTβ-actin，ΔΔCT ＝ ΔCT腫瘤組-ΔCT對照組，mRNA 相對表達量 ＝ 2－ΔΔCT［3］。

1.4 W estern blot檢測IKKε蛋白表達 RIPA裂解液裂解，冰上消化15min，離心取上清并行BCA法定量， 30μg蛋白上樣于10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜并用1%脫脂奶粉于室溫條件下封閉2 h，一抗（IKKε1∶1000稀釋，GAPDH 1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，次日 PBS洗5 min，3次，HRP標記的二抗孵育 1 h，PBS洗5 min，3次，將超敏發光液加在PVDF膜上，曝光顯影，凝膠成像系統采集圖像對每個樣本光密度值進行分析，光密度掃描儀檢測出目的條帶圖像峰面積值，以峰面積值的比值代表蛋白的表達量。

1.5 統計學處理 實驗均獨立重復3次。實驗數據采用SPSS 11.5處理，χ2檢驗、單因素方差分析和spearman相關分析法進行分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 免疫組化顯示IKKε蛋白的染色 免疫染色的結果顯示7例對照腦組織中6例無IKKε蛋白的表達，1例為低表達；5例Ⅰ級毛細胞性星型細胞瘤4例無表達，1例IKKε蛋白中表達。11例Ⅱ級星型細胞瘤9例低表達，2例高表達；8例少突膠質細胞瘤均低表達。9例Ⅲ級間變型星型細胞瘤5例高表達，2例中表達，1例低表達，1例無表達；間變型少突膠質細胞瘤4例高表達，1例中表達，1例低表達。12例Ⅳ級膠質母細胞瘤11例高表達，1例低表達。在膠質瘤標本中，IKKε蛋白主要定位于細胞漿，表現為黃色或棕黃色著色（圖1），在對照腦組織和不同級別膠質瘤中IKKε的陽性表達率分別為14%、88%，兩者比較差異具有統計學意義（χ2＝ 12.583，P ＜ 0.05），spearman 相關分析提示IKKε 和腫瘤級別呈正相關 （r＝ 0.513，P ＜ 0.05）。此外，膠質瘤組織IKKε蛋白的表達在不同性別、組織學及年齡中無明顯差異 （P ＞ 0.05）（表 1），差異不具有統計學意義。

2.2 IKKεm RNA 表達結果 見表 2，IKKε在不同級別膠質瘤組織中隨著腫瘤惡性程度的增加，其 mRNA平均表達量 2－ΔΔct也明顯增加，對照組IKKε mRNA 相對表達量（1.73±0.15）明顯低于膠質瘤組（5.84 ± 0.56）（t＝ 23.734， P ＜ 0.05）；膠質瘤I～Ⅱ級組和膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級組行方差分析顯示IKKεmRNA在膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級中的表達高于膠質瘤 I～Ⅱ級（t＝ 17.587，P ＜ 0.05），見表 2。

圖1 免疫組化染色檢測對照腦組織及不同級別膠質瘤組織中IKKε 細胞內分布及表達量（×200）。 a：對照組；b：Ⅰ級組；c：Ⅱ級組；d：Ⅲ級組；e：Ⅳ級組

圖2 Western blot檢測對照腦組織（c）及不同級別（Ⅰ～Ⅳ）膠質瘤組織中IKKε蛋白表達水平

表1 膠質瘤中IKKε表達特點

表2 IKKεmRNA在對照腦組織及人腦膠質瘤中的表達（±s）

表2 IKKεmRNA在對照腦組織及人腦膠質瘤中的表達（±s）

1）經t檢驗，對照組與膠質瘤組比較，P＜0.052）經 LSD-t檢驗，對照組、Ⅰ～Ⅱ級組和Ⅲ～Ⅳ級組兩兩比較，P 均 ＜ 0.05

組別對照組膠質瘤組I～Ⅱ級Ⅲ～Ⅳ級n 7 5 1 24 27 IKKεmRNA（x± s）1.73 ± 0.15 5.84 ± 0.561）4.85 ± 0.142）7.21 ± 0.322）

2.3 IKKεW estern blot結果 見圖 2，對照組織中 IKKε 蛋白表達（0.139 ± 0.009）明顯低于膠質瘤組織 （2.117±0.063）， 在腫瘤蛋白中不同級別的IKKε蛋白含量也有顯著差異差異，且隨著膠質瘤級別的增高，IKKε的蛋白表達量也隨之增加 （P＜0.05）。 其 中Ⅰ級（0.848 ± 0.028）、Ⅱ級 （1.502 ±0.152）、 Ⅲ 級 （2.411 ± 0.151）、 Ⅳ 級 （3.707 ±0.287）。

3 討論

近年，大量研究聚焦于慢性炎癥和癌癥的聯系，經典IKK激酶IKKα、IKKβ和核轉錄因子NF-κB被證實是起橋梁作用的重要的因子［4］。新近的研究揭示IKK相關激酶IKKε和TBK1不僅調控先天免疫反應和炎癥反應，也參與眾多影響細胞轉化和腫瘤進程的通路，尤其是NF-κB通路［5］。有報道證實 IKKε 在乳腺癌［6］、卵巢癌［7］、前列腺癌［8］中異常表達，Guo 等［7，9］還發現 IKKε 與卵巢癌對順鉑的耐藥以及乳腺癌對他莫昔芬耐藥機制密切相關。

IKKε作為IKK家族成員之一，其編碼基因為IKBKE（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells， kinase epsilon），該基因定位于1q32，包括N端激酶區域，類泛素區域，C端LZ（亮氨酸拉鏈）結構，以及參與磷酸轉移酶活性調節的HLH（Helix-Loop-Helix）基序。IKKε與傳統的 IKKα、IKKβ結構上分別有33%和31%的同源性，并且 IKKε 過表達可誘導 NF-κB 活化［10］。 Adliet［11］等發現IKKε在前列腺癌和乳腺癌細胞中表達上調，進一步研究顯示IKKε可磷酸化Ser536端激活NF-κB，且阻斷該途徑可以抑制腫瘤細胞增殖。Sonenshein等［12］證實 IKKε在乳腺癌細胞系 MB231和Hs578T，4／6個乳腺癌病人以及致癌物誘導的鼠類乳癌腫瘤中持續表達。此外，在缺乏IKKε激酶活性的乳腺癌細胞中NF-κB的兩個靶向基因Cyclin D1、RelB表達減少，且細胞侵襲力和致瘤性降低。Boehm等［6］使用三個互補的基因組方法確定IKKε為乳腺癌基因，他們建立一個依賴MEK和AKT信號的細胞轉化模型，通過篩選替代AKT和誘導腫瘤發生的激酶，發現 IKKε基因在 8／49（16.3%）細胞系和30%的標本中擴增，FISH分析進一步證實在另外的10份標本IKKε拷貝數的增加是其編碼基因擴增的結果。免疫染色揭示乳腺癌中IKKε發揮其癌基因作用功能是通過NF-κB因子cREL的核內聚集。而許多腫瘤細胞系中發現過表達的IKKε還可以磷酸化p65的Ser536端，并且NF-κB上游抑制劑可以阻斷IKKε誘導的細胞轉化。還有研究表明IKKε促進膠質瘤細胞抗凋亡， 采用免疫組化檢測 53.5%（38／71）膠質瘤表達IKKε且認為IKKε的過表達與腫瘤級別無相關［13］。

本實驗通過免疫組化染色發現在膠質瘤組織中IKKε蛋白的陽性率為88%，而對照腦組織幾乎無表達。 在對前列腺癌的研究中 Pe′ant等［14］證實IKKε可以促進炎性因子IL-6和IL-8分泌并且IKKε并不靶向NF-κB，免疫染色進一步發現IKKε定位于前列腺癌細胞細胞核。本實驗顯示IKKε定位于膠質瘤細胞漿，這說明IKKε表達具有組織特異性，且高級別膠質瘤（Ⅲ～Ⅳ級）細胞胞漿染色顯著強于低級別膠質瘤（Ⅰ～Ⅱ級）。我們的結果和之前報告的IKKε與膠質瘤級別不相關的結果不一致，我們認為IKKε可能直接參與了膠質瘤的發生及其惡性進展，其和腫瘤級別正性相關。Western blot在蛋白水平亦顯示相同的結果，并且考慮可能IKKε對于膠質瘤中星形細胞型的惡性轉化起著一定的作用。Real-time PCR結果顯示隨著腫瘤級別增高，膠質瘤組織中的IKKεmRNA表達量也相應增加，尤其是惡性度最高的膠質母細胞瘤組織中IKKεmRNA的表達明顯高于低級別膠質瘤腦組織，表明IKKε在轉錄水平上的表達結果與在翻譯水平上的表達結果具有一致性， 提示IKKε基因表達調控的主要環節在轉錄或翻譯水平上，IKKε參與并促使腫瘤發展和惡性轉化。以上結果表明：與對照腦組織相比， 膠質瘤組織中的IKKε異常上調，在不同分化程度的膠質瘤組織中IKKε蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05）。綜上所述，膠質瘤細胞IKKε表達上調且其表達程度與膠質瘤惡性程度成正相關，提示IKKε可作為膠質瘤發展及判斷預后的指標之一，可能與人腦膠質瘤的發生及惡性進展有關。

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The expression and significance of IKKε gene in Human gliomas.

LIHuibing，YU Kai，ZHANG Anling，WANG Kun，WAN Guangxiu，KANG Chunsheng，HUANG Qiang.Department of Neurosurgery，Tianjin Medical University General Hospital and Laboratory of Neuro-Oncology，Tianjin Neurological Institute， No.154 Anshan Road， Heping Distrct， Tianjin 300052， China.Tel： 022－60814468.

ObjectiveTo investigate the expression and significance of IKKε in humam gliomas of different grades. M ethods Fifty-one fresh glioma specimens with a defined histological grade including 24 ofⅠ～Ⅱ grade glioma， 27 ofⅢ～Ⅳ grade glioma were collected and 7 normal brain tissue samples served as a control.real-time PCR and Western blotwere used to detect IKKεmRNA and protein expression， respectively.Immunohistochemical staining was used to detect the cellular localization of IKKε.Results IKKεmRNA and protein expression levels were significantly higher in human glioma than in normal brain tissue.IKKεmRNA and protein levels were significantly higher inⅢ～Ⅳgrade glioma group than in Ⅰ～Ⅱgrade group（t＝ 21.587，P＜ 0.05）.Western blot showed no expression of IKKε in control group （6／7）， moderate／high expression of IKKε in 3／24 ofⅠ～Ⅱ grade glioma and 23／27 ofⅢ～Ⅳ grade glioma.Immunohistochemical staining showed the IKKεimmunoreactivitymainly in the cytoplasm.In addition， IKKε expression was positively correlated with the grade of human glioma （r＝ 0.513，P＜ 0.05）.Conclusion ThemRNA and protein expression levels of IKKεis significantly high in human glioma which is positively associated with the grade of glioma.Therefore， IKKεmay be related to the occurrence andmalignant development of human glioma.

Glioma IKKε Pathological grade

（E-mail：Huang Qiang209＠yahoo.com.cn）

R651

A

10.3969 ／j.issn.1002－0152.2012.06.001

☆ 國家自然科學基金（編號：81172405）資助

* 天津醫科大學總醫院神經外科，天津市神經病學研究所神經

腫瘤研究室（天津 300052）

2011－12－12）

甘章平）

·論 著·