人肝臟膠原樣凝集素1在肝癌細胞株HepG2內的定位及其功能探討

明 亮，王萬海，李付廣，張世杰，任春峰，尹慧卿

(1鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052;2鄭州大學基礎醫學院)

人肝臟膠原樣凝集素l(CL-L1)是膠原樣凝集素家族的新成員之一［1，2］。機體內膠原樣凝集素的主要功能是通過識別外來病原體表面上病原相關分子模式，參與區分“自己”和“非己”糖結構，從而在抗病原體感染和宿主防御中發揮重要作用［3］。目前已發現的膠原樣凝集素中多數為分泌蛋白，存在于體液和分泌液中，只有CL-L1為可溶性胞質內蛋白［4］。因此，推測CL-L1可能具有其獨特的功能，但目前對其功能的了解甚少。為此，2011年11月1日～2012年5月31日，我們觀察了CL-L1在肝癌細胞株HepG2的定位，并通過pcDNA3.1/myc-his-CL-L1和pEGFP-N1載體將CL-L1基因轉染HepG2細胞，觀察其克隆形成能力，探討CL-L1的功能。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞株HepG2，pEGFP-N1載體，大腸桿菌DH5α。DMEM培養液和胎牛血清，工具酶，其他試劑及材料見文獻［3］。

1.2 方法

1.2.1 載體pcDNA3.1/myc-his-CL-L1和pEGFPN1-CL-L1的構建 采用已構建好的含有人全長CL-L1 cDNA的真核表達載體pcDNA3.1/myc-his-CL-L1及pEGFP-N1-CL-L1［3］，酶切鑒定和序列分析顯示插入的目的片段DNA序列與讀碼框完全相符。

1.2.2 基因轉染 在直徑35 mm的細胞培養皿中接種3×105個HepG2細胞，置5%CO2、37℃培養箱中培養20 h。配置轉染液:1號液(2 μg的pcDNA3.1/myc-his-CL-L1質粒+無血清、無抗生素的DMEM培養液 250 μL)，2號液(5 μL的 Lipofectamine 2000+無血清、無抗生素的DMEM培養液250 μL)，將配好的1、2號液混合，即為轉染液，室溫靜置30 min。培養的HepG2細胞去上清，用無血清和無抗生素的DMEM培養液洗2次，加入1 mL無血清和無抗生素的DMEM培養液后逐滴加入轉染液，邊加邊搖動［5］。細胞培養6 h后，去除轉染液，換成DMEM完全培養液繼續培養42 h。

1.2.3 HepG2細胞內CL-L1蛋白檢測 HepG2細胞轉染pcDNA3.1/myc-his-CL-L1后48 h，收集細胞蛋白(以轉染空載質粒的細胞作對照)，BCA法進行蛋白定量后，各取50 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳并轉印至PVDF膜，用Western blot法進行檢測分析。

1.2.4 HepG2細胞克隆形成實驗 HepG2細胞轉染pcDNA3.1/myc-his-CL-L1后24 h，消化全部細胞，轉移到細胞培養皿中再繼續培養24 h，加G418至終濃度800 mg/L，每3～4 d換液1次，直至長出肉眼可見的克隆，吸去培養液，考馬斯亮藍染色過夜，拍照。以轉染空載質粒的細胞作對照。

1.2.5 HepG2細胞內CL-L1蛋白的定位 ①激光共聚焦顯微鏡觀察法:在直徑35 mm的細胞培養皿中接種2×105個 HepG2細胞，將培養皿置5% CO2、37℃培養箱中培養20 h。配置轉染液:3號液(2 μg質粒+無血清、無抗生素的DMEM培養液100 μL)，4號液(4 μL的Lipofectamine 2000+無血清、無抗生素的DMEM培養液100 μL)，將配好的3、4號液混合，即為轉染液，室溫靜置 30 min。HepG2細胞于轉染液中轉染pEGFP-N1-CL-L1后48 h(以轉染空載質粒的細胞作對照)，吸去轉染液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%TritonX-100破膜5 min，封片液(含Dapi)封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察CL-L1蛋白在細胞內的定位。②熒光標記觀察法:用內質網特異性熒光染料ER-Tracker Blue-White DPX和高爾基體特異的紅色熒光探針染料BODIPY TR C5-Ceramide對轉染后的HepG2細胞的內質網及高爾基體分別進行染色［2］。在330～385 nm激發光下觀察內質網特異探針發出的藍色熒光，460～490 nm激發光下觀察EGFP融合蛋白發出的綠色熒光，在545～580 nm激發光下觀察高爾基體特異探針發出的紅色熒光，圖象重疊觀察EGFP融合蛋白在HepG2細胞內的定位。

2 結果

2.1 轉染pcDNA3.1/myc-his-CL-L1的HepG2細胞中CL-Ll蛋白的表達 pcDNA3.1/myc-his-CL-L1轉染HepG2細胞后，其CL-L1蛋白明顯高表達，轉染空載質粒的細胞未見CL-L1蛋白表達，見圖1。

圖1 注:1:轉染重組質粒pcDNA3.1/myc-his-CL-L1的HepG2細胞內的CL-L1蛋白;2:轉染空載質粒的HepG2內細胞未見CL-L1蛋白表達;β-actin為內對照，顯示上樣量一致

2.2 轉染pcDNA3.1/myc-his-CL-L1的HepG2細胞克隆形成能力 轉染重組質粒pcDNA3.1/mychis-CL-L1的HepG2細胞經G418篩選后4周左右，與轉染空載質粒的細胞相比其克隆形成能力明顯下降，見圖2。

圖2 注:1:轉染空載質粒的HepG2內細胞形成的克隆;2:轉染重組質粒pcDNA3.1/myc-his-CL-L1的HepG2細胞形成的克隆

2.3 CL-L1蛋白在HepG2內的定位 激光共聚焦顯微鏡觀察發現CL-L1蛋白(顯示綠色熒光)定位于HepG2細胞的細胞質基質中。熒光標記法顯示CL-L1蛋白廣泛分布于HepG2的細胞質內，不在高爾基體和內質網中表達。

3 討論

膠原樣凝集素家族是一類含有膠原樣結構域的C型凝集素，目前已鑒定出8個成員，包括甘露聚糖結合凝集素(MBL)、兩種表面活性物質(SP-A、SPD)、腎臟膠原樣凝集素1(CL-K1)、胎盤膠原樣凝集素1(CL-P1)、膠固素和膠原樣凝集素-43(CL-43)以及CL-L1［5］。膠原樣凝集素通過糖識別結構域特異性來識別病原體包膜糖基，發揮中和、凝集、調理作用或補體激活作用而抑制病原微生物的感染，在固有免疫中發揮重要作用［3，6，7］，也可調節適應性免疫系統的功能［8］。

肝癌的發生發展與病毒侵襲密切相關，特別是與病毒包膜的糖基密切相關。在本研究中，我們發現CL-L1融合蛋白的綠色熒光與內質網、高爾基體不重疊，說明融合蛋白存在于HepG2細胞的細胞質基質中，而不存在于其內質網和高爾基體內。CL-L1是已發現的惟一存在于胞質基質中的膠原樣凝集素蛋白，可能具有獨特的生物學作用。HepG2細胞轉染CL-L1基因后，克隆形成能力明顯下降。推測CL-L1基因可能是肝癌相關抑制基因。

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