鹽酸美金剛對(duì)兔受損視神經(jīng)的保護(hù)作用

胡麗榮，肖 倩，王景春，李金明，楊 峰，張愛軍，王福海

(1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000;2唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院)

目前，視神經(jīng)損傷的治療手段主要是早期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素并行視神經(jīng)管減壓術(shù)。Mariak等［1］通過對(duì)視神經(jīng)損傷患者3～11 a的臨床隨訪觀察后認(rèn)為，經(jīng)過上述兩種方法的治療并不能有效阻止視神經(jīng)萎縮的發(fā)生。谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過作用于其受體而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。研究表明，谷氨酸興奮毒性是視神經(jīng)受壓、挫傷、切斷及缺血等導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷和死亡的主要機(jī)制之一［2］。從理論上講，應(yīng)用谷氨酸受體拮抗劑，可以減輕和預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷。鹽酸美金剛是一種非競(jìng)爭(zhēng)性谷氨酸受體拮抗劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3］證實(shí)，其對(duì)缺血缺氧性損傷視神經(jīng)有保護(hù)作用。2011年6月18日～8月25日，我們通過制作兔視神經(jīng)損傷模型，采用鹽酸美金剛治療，觀察其視網(wǎng)膜谷氨酸濃度變化及視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)變化，探討其對(duì)兔受損視神經(jīng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康大白兔(由本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 兔視神經(jīng)損傷模型的制作 用1g/L的烏拉坦經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉。剪開實(shí)驗(yàn)兔外眥5 mm，縫線開瞼，于顳上方角膜緣處剪開球結(jié)膜，在上直肌、外直肌的止端做牽引縫線，將眼球牽向鼻下方，鈍性向球后分離，暴露視神經(jīng)，用中號(hào)顯微血管夾(夾持力為98 g)在球后3 mm處夾持視神經(jīng)20 s，制成視神經(jīng)損傷模型［4］。經(jīng)檢查，眼球無明顯突出，眼瞼閉合完全，術(shù)眼瞳孔散大，直接光反射遲鈍或消失，眼底檢查無視網(wǎng)膜出血及血管阻塞者為成功的視神經(jīng)損傷模型并納入實(shí)驗(yàn)。妥布霉素沖洗術(shù)野，縫合球結(jié)膜及外眥，術(shù)眼滴氯霉素眼藥水、涂紅霉素眼藥膏。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法 隨機(jī)選擇具備入選條件的健康大白兔18只作為對(duì)照組(A組)，不作任何處理。選造膜成功的兔子48只，隨機(jī)分為損傷生理鹽水組(B組)24只、損傷治療組(C組)24只，B、C兩組又隨機(jī)分為B1組18只、B2組6只及C1組18只、C2組6只。B、C兩組兔子雙眼制作視神經(jīng)損傷模型后，C組每日上午一次性給予鹽酸美金剛灌胃，每日每只兔子10 mg(溶于5 mL生理鹽水中);B組給予生理鹽水5 mL灌胃，給藥時(shí)間同C組。

1.4 視網(wǎng)膜谷氨酸檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察 造模后第1、3、7、14、21、28天隨機(jī)處死(擊頭處死)A組兔子3只、B1組3只、C1組3只，迅速摘取眼球(雙眼)，去除眼前節(jié)，剝離視網(wǎng)膜并稱重、勻漿，置入EP管，－80℃冰箱保存，用于檢測(cè)視網(wǎng)膜谷氨酸濃度(用高效液相色譜法)。同樣時(shí)間點(diǎn)，選取B2組兔子1只、C2組1只處死(擊頭處死)，在眼球顳側(cè)標(biāo)記，取雙側(cè)眼球后多聚甲醛固定，石蠟包埋，在視盤顳側(cè)2～3 mm處制作視網(wǎng)膜切片，HE染色，光電顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)，用麥克奧迪數(shù)碼分析系統(tǒng)攝取圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)比較用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組視網(wǎng)膜谷氨酸濃度比較 檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可見，視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜谷氨酸濃度迅速增高，第3天達(dá)高峰后開始下降，第14天時(shí)仍較高，第21天后基本恢復(fù)至正常水平。與B1組相比，第1～4天C1組谷氨酸濃度明顯降低。

2.2 各組視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 B2組視網(wǎng)膜形態(tài)變化:傷后第1天，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯水腫，外形不規(guī)則;傷后第3天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞部分空泡樣變，內(nèi)核層細(xì)胞水腫，排列稀疏;傷后第7天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞外形皺縮，部分核固縮;傷后第14天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，殘存細(xì)胞不規(guī)則，損傷嚴(yán)重;傷后第21天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量損失嚴(yán)重，偶見殘存的細(xì)胞(皺縮，核固縮);傷后第28天，與傷后第21天相似。C2組視網(wǎng)膜形態(tài)變化:傷后治療第1天，神經(jīng)纖維層水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度水腫，排列欠規(guī)則;傷后治療第3天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度水腫，少數(shù)細(xì)胞空泡樣變;傷后治療第7天，可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，水腫好轉(zhuǎn)，排列較規(guī)則;傷后治療第14天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較第7天未見明顯減少，細(xì)胞外形、排列規(guī)則;傷后治療第21天，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量未見繼續(xù)減少，可見少量外形皺縮、核固縮細(xì)胞;傷后治療第28天，可見外形皺縮、核固縮的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，大部分細(xì)胞外形、排列規(guī)則。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組網(wǎng)膜谷氨酸濃度比較(μmol/g，±s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組網(wǎng)膜谷氨酸濃度比較(μmol/g，±s)

注:與A組相比，*P＜0.05;與B1組相比，△P＜0.05

組別 眼谷氨酸第1天 第3天 第7天 第14天 第21天 第28天A組 6 22.16±2.83 25.89±3.70 24.83±4.60 28.33±2.37 25.96±2.89 23.25±3.96 B1組 6 105.83±7.57* 138.95±5.52* 88.30±5.54* 48.36±5.07* 28.04±2.34 26.13±3.83 C1組 6 63.89±3.84＊△ 67.48±4.51＊△ 33.32±3.79＊△ 25.40±3.97△24.78±4.50 25.09±4.89

3 討論

正常情況下，從突觸釋放的谷氨酸進(jìn)入突觸間隙后，大部分被神經(jīng)末梢重新攝取再利用，也有部分被Müller細(xì)胞從突觸間隙運(yùn)走，為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供營養(yǎng)和保護(hù)［5］。Otori［6］發(fā)現(xiàn)，谷氨酸濃度升高會(huì)引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，并呈劑量依賴性。陳橞樺等［7］經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，兔眼部鈍挫傷后，玻璃體內(nèi)谷氨酸濃度升高，并且誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，兔視神經(jīng)損傷后其視網(wǎng)膜谷氨酸濃度迅速升高，第3天達(dá)高峰后開始下降，第14天時(shí)仍高于正常對(duì)照組;光鏡下視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察可見，傷后第1天，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯水腫，第3天神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，從第7天開始神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞外形皺縮，核固縮，至傷后第21天時(shí)，正常的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量損失嚴(yán)重，偶見殘存的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦是形狀不規(guī)則、核固縮，第28天較21天無明顯變化。

谷氨酸通過作用于其受體而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，目前已發(fā)現(xiàn)其受體有5個(gè)亞型，即NMDA、KA、AMPA、L-AP4、ACPD，后四種合稱為非NMDA受體。NMDA受體與Ca2+通道偶聯(lián)并與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系更為密切［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔視神經(jīng)損傷后給予鹽酸美金剛治療，其視網(wǎng)膜谷氨酸濃度明顯低于未治療者;C組雖然在視神經(jīng)損傷后第1天、第3天時(shí)可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水腫，排列欠規(guī)則，但明顯輕于B組，從第7天開始，水腫已趨于好轉(zhuǎn)，排列也變得規(guī)則，直到第21天時(shí)，可發(fā)現(xiàn)外形皺縮、核固縮的細(xì)胞，但大部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外形、排列規(guī)則。以上結(jié)果說明谷氨酸受體拮抗劑鹽酸美金剛對(duì)受損的視神經(jīng)有一定的保護(hù)作用。

鹽酸美金剛是金剛烷胺的二甲級(jí)衍生物，是一種非競(jìng)爭(zhēng)性的NMDA受體拮抗劑，美國食品與藥物管理局于2004年10月批準(zhǔn)將該藥用于治療帕金森病，加拿大于2004年10月批準(zhǔn)將該藥用于治療阿爾茨海默病。在本實(shí)驗(yàn)中，每只兔子每日給予10 mg的鹽酸美金剛頓服，兔飲食飲水正常，排尿排便正常，無狂躁跡象;兔眼結(jié)膜無明顯充血，角膜透明，前房深淺正常，眼底未見出血等改變。因此，我們推測(cè)，每日10 mg劑量的鹽酸美金剛是相對(duì)安全的。

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