類風濕關節炎患者Ⅱ型膠原蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

王安宇，魏良綱，喬藝杰，張 超，張定安，何光志

(1貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴陽550002;2貴陽中醫學院基礎醫學院)

類風濕關節炎(RA)是一種主要由T細胞介導，以慢性、復發性多滑膜關節炎為主要表現的系統性、炎癥性、自身免疫性疾病［1］。有研究［2］表明，Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)在RA的發病中發揮著主要的作用，被認為是最重要的RA自身抗原之一。理論上，若以適宜濃度的CⅡ誘導人體免疫耐受，就有可能預防RA的發生。Trentham等［3］采用雞天然CⅡ治療RA，取得了顯著療效。宋新強等［4］用構建的雞Ⅱ型膠原基因疫苗治療大鼠關節炎，其關節炎癥狀明顯改善，更是有力地支持這一觀點。目前尚無人Ⅱ型膠原基因疫苗的報道。本研究擬克隆出人Ⅱ型膠原蛋白cDNA(hCⅡcDNA)，為后續的基因真核表達載體即基因疫苗的構建打下基礎，為人CⅡ基因疫苗對RA的防治作用及其機制的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 人關節軟骨組織來自貴陽中醫學院第二附屬醫院類風濕科的需做關節切除術(關節置換術)的RA患者(漢族，女性，42歲)。總RNA抽提試劑盒和逆轉錄試劑盒為GIBCOBRL公司產品;DNA Marker DL10000(5000)、TaqPCR MasterMix、凝膠DNA回收試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產品;大腸桿菌DH5α及pMD18-T Vector、PCR引物合成試劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人關節軟骨組織總RNA的提取 從－80℃冰箱中取出冷凍關節軟骨組織，切取組織約1 g，置于研缽中磨成粉末，然后按RNA提取試劑盒說明提取關節軟骨組織總RNA。

1.2.2 hCⅡcDNA的擴增 以抽提的總RNA為模板，以Oligo dT(18)為反轉錄引物，按照Promega逆轉錄試劑盒說明操作，反應體系:42℃ 60 min，95℃10 min。根據Genebank中公布的編碼人Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001844)，利用Primer Primer 5.0軟件設計引物序列。引物為5'-CGCGGATCCATGATTCGCCTCGGGGCTC-3' (含BamHⅠ酶切位點)、5'-CCCAAGCTTCAAGAAGCAGACCGGCCCTATG-3'(含 HindⅢ酶切位點)。PCR反應體系:2×TaqPCR MasterMix 25 μL，cDNA產物3 μL，無菌水19 μL，上下游引物各1.5 μL。反應程序:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環擴增35次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物的回收 將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min后，在紫外燈下觀察并切下含有目的條帶的凝膠，按照凝膠回收試劑盒說明回收DNA片段。回收產物－20℃保存。

1.2.4 hCⅡcDNA的克隆與測序 將擴增的hCⅡcDNA PCR產物與pMD18-T載體連接，然后轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，并將其鋪于含有氨芐青霉素的LB培養基中，37℃培養12～16 h觀察結果。挑取菌落并接種于LB培養液中，取2 μL的菌液為模板進行PCR鑒定，PCR結果呈現特異性條帶為hCⅡcDNA陽性。取hCⅡcDNA陽性的克隆菌株送大連寶生物工程有限公司測序。

2 結果

從關節軟骨組織中提取細胞總RNA后，RTPCR方法擴增得到接近5 000 bp的條帶，其大小與編碼人的Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_ 001844)長度相近(見圖1)。

圖1 CⅡ基因RT-PCR擴增產物電泳結果注:M:DL 10000標準分子量;1:RT-PCR擴增產物

回收純化的目的產物與載體連接，轉化感受態細菌DH5α，取2 μL培養的重組克隆菌液為模板做菌落PCR鑒定，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得接近5 000 bp的條帶，其大小與編碼人Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001844)長度相近(見圖2)。

圖2 CⅡ基因克隆載體pMD18-T-CⅡ酶切片段電泳結果注:M:DL 10000標準分子量;1:pMD18-T-CⅡ雙酶切產物

PCR鑒定為hCⅡcDNA陽性的克隆菌株，經大連寶生物有限公司測序證實其大小為4 464 bp。對測序結果進行分析，經BLAST搜索發現其與Genebank中公布的人編碼Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001844)同源性為99%。

3 討論

hCⅡ具備由三條相同的a1(Ⅱ)鏈組成的三螺旋結構域，是關節軟骨中膠原網絡的主要成分，占軟骨干重的一半以上。CⅡ基因的突變會導致以軟骨畸形為特征的軟骨發育不全［5］。有研究［6］表明，在RA發病中，CⅡ激發由T細胞介導的免疫反應，極可能是RA的始動靶抗原［7］。因此，若以適宜濃度的CⅡ對RA患者進行治療，誘導免疫耐受，就有可能改善患者癥狀;對于未患病人群，甚至可能預防RA的發生。對此，美國科學家Trentham等在國際上首先采用雞天然Ⅱ型膠原治療RA，取得了顯著療效［3］，更是有力地支持這一觀點。但是，系統而深入的研究發現，直接口服自身抗原誘導免疫耐受存在諸多不足，如抗原在消化系統易被降解、維持時間不長［8］、免疫耐受誘導率不高、耐受的維持需反復給藥等，而且所需蛋白表達和純化過程較為繁瑣，難以獲取大量、高純度所需抗原［9］。而近些年興起的基因疫苗具有操作簡單、抗原性強、表達時間長久等特點，能有效避免上述缺點，同時為控制免疫反應提供了一種新手段，并可能成為一種重要的預防手段和治療方法［10］。宋新強等［4］首先提出構建雞的Ⅱ型膠原基因疫苗治療誘導的大鼠關節炎，取得了顯著療效，且膠原基因疫苗避免了上述口服抗原的缺點。目前還沒有關于構建人Ⅱ型膠原基因疫苗方面的報道。

本研究從貴州漢族女性RA患者的關節軟骨組織中提取總RNA，以Oligo dT(18)作為反轉錄引物，并以抽提的總RNA作為模板，將其反轉錄為cDNA，通過設計引物，應用PCR技術擴增出hCⅡcDNA (或hCOL2A1)，經克隆測序并通過BLAST系統分析發現其與Genebank中公布的人編碼Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001844)同源性為99%，這表明成功克隆出了hCⅡcDNA(或hCOL2A1);此外，該擴增產物與猩猩的CⅡα1鏈基因序列同源性為98%，與非洲象(XM_003405744)的CⅡα1鏈基因同源性為92%，與家犬編碼Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001006951)的同源性為92%，與牛編碼Ⅱ型膠原蛋白 α1鏈的基因序列(NM_ 001001135)的同源性為91%，與蒙古馬編碼Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的基因序列(NM_001081764)的同源性為93%。表明CⅡ在不同物種間具有高度保守性。

［1］De Bellis A，Bizzarro A，Pivonello R，et al.Prolactin and autoimmunity［J］.Pituitary，2005，8(1):25-30.

［2］Sapadin AN，Fleischmajer R.Tetracyclines:nonantibiotic properties and their clinical implications［J］.J Am Acad Dermatol， 2006，54(2):258-265.

［3］Trentham DE，Dynesius-Trentham RA，Orav EJ，et al.Effects of oral administration of typeⅡcollagen on rheumatoid arthritis［J］.Science，1993，261(5129):1727-30.

［4］宋新強，駱媛，王丹，等.雞Ⅱ型膠原基因疫苗PcDNA-CCOL2A1能有效治療大鼠類風濕性關節炎［J］.中國科學，2006，36(6): 534-542.

［5］左曉霞.凱利風濕病學［M］.北京:人民衛生出版社，2006:12-17.

［6］Min SY，Hwang SY，Park KS，et al.Induction of IL-10-producingT cells in animal model of collagen-induced arthritis by oral administration of type II collagen［J］.Arthritis Res Ther，2004，6(3):213-219.

［7］Matsumoto I.The pathogenic role and production system of autoantibody in rheumatoid arthritis［J］.Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi，2005，28(6):365-371.

［8］Kim WU，Park JS，Ryoo JW，et al.Suppression of collagen induced arthritis by singleadministration of poly(lactic-co-glycolic acid)nanoparticles entrapping CⅡ:a noveltherapeutic strategy for oral tolerance［J］.Arthritis Rheum，2000，46(4):1109-1120.

［9］蔣鐵建，周智廣，蘇恒，等.人谷氨酸脫羧酶DNA疫苗的構建與鑒定［J］.中國免疫學雜志，2004，20(2):125-126.

［10］Piccirillo CA，Prud-homme GJ.Immune modulation by plasmid DNA-mediated cytokine gene transfer［J］.Curr Pharm Des，2003，9(3):83-94.