調督通脈針灸法對佐劑性關節炎大鼠滑膜TNF－α、IL－10表達的影響

王興，張秀榮，張鴻婷，陳會君，郭丹丹

(黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

RA是免疫介導的炎癥性疾病，細胞因子網絡失調與RA發病及病程進展密切相關。腫瘤壞死因子－a(TNF－a)具有許多復雜的生物學效應，是免疫反應、組織損傷及炎癥的主要介質之一，在RA的發病機制中占主要地位。RA的發病的病理基礎為滑膜細胞的增生、血管翳的形成及骨質的破壞，TNF－a與其密切相關并起“中心罪犯”作用。IL－10是細胞因子合成的抑制因子。IL－10具有抑制中性粒細胞、單核細胞等產生細胞因子的作用，還能降低血清及關節液內炎性細胞因子含量，改善佐劑關節炎(AA)大鼠的病情，明顯抑制免疫細胞炎性細胞因子的產生，發揮抗炎作用。本課題以AA大鼠為研究對象，研究細胞因子TNF－a，IL－10在佐劑性關節炎大鼠滑膜中表達的變化，以探討上述細胞因子在類風濕性關節炎疾病過程的作用，為闡明調督通脈針灸法治療RA的機制作初步探討，為針灸治療RA提供理論依據。

1 實驗材料

1．1 實驗動物

Wistar大鼠，60只，體質量(200±10)g，潔凈級，雌雄各半，黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。動物在實驗前適應性馴養1周，動物房濕度、溫度分別維持在70%、20℃左右。

1．2 主要儀器

BACKMAN DU－640型蛋白質核酸分析儀(美國);EPPERFOR2002型梯度PCR儀(德國);SIMF124型落地式碎化冰塊制冰機(日本三洋);低溫冰箱MDF－USOV型(日本三洋);超凈工作臺(杭州);生物顯微鏡OLYMPUS BX60(日本OLYMPUS公司);數字凝膠成像系統(美國安萊公司);DJA多功能艾灸儀(北方中醫器械廠)。

1．3 主要試劑

RT－PCR試劑盒(美國Promega公司);二乙基焦碳酸酷(美國 Promega公司);PCR Marke(美國 Promega公司);Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司);PCR Marke(美國 Promega公司);Taq酶(美國Promega公司);lO×bufev(原平皓生物技術公司);完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)。

2 實驗方法

2．1 AA大鼠模型制作

將Wistar大鼠60只適應性喂養7天后，先隨機抽取10只，右后足跖底部常規皮膚消毒后，用微量注射器于右側后肢足墊皮內注射0.1ml生理鹽水，余50只大鼠足跖底部常規皮膚消毒后，用微量注射器于右側后肢足墊皮內注射0.1ml完全弗氏佐劑［1－2］。將注射生理鹽水的10只大鼠作為空白對照組(A組)，將注射CFA后第12天時出現繼發反應明顯的大鼠選擇30只，隨機分成模型對照組(B組)、普通針灸組(C組)、調督通脈針灸組(D組)，每組10只，接受相應處理與治療。

2．2 方法

A組和B組:實驗開始后與針灸治療組在同樣的時間，用同樣的方法固定，不做任何治療;C組:將大鼠固定，參照《中國獸醫針灸學》選取雙側腎俞穴之間，用多功能艾灸儀灸療，同時用0.28mm×25mm毫針針刺雙側足三里，每日1次，每次15min，治療中間行針1次，采用平補平瀉法，共治療14天;D組:與C組同樣的方法固定，用相同規格的毫針依次平刺腰陽關、命門、大椎、百會、足三里、曲池，同時選取雙側腎俞穴之間，用多功能艾灸儀灸療，每日1次，每次15min，治療中間按上述穴位順序行針1次，采用平補平瀉法，共治療14天。

3 標本采集

膝關節取材:大鼠稱質量，用20%烏拉坦腹腔麻醉(4ml/kg)，仰位固定，沿左側后腿膝關節正中縱行切開皮膚，直至暴露出以膝關節為中心約3cm×3cm的區域，可見白色的髕韌帶，沿髕韌帶下方將其剪開，用止血鉗夾住髕韌帶斷端將髕骨向上掀起，再分別沿髕骨兩側向上分離至股骨，此時即打開了膝關節腔，可見由髕骨下極向下延續有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織，用眼科剪緊貼關節面邊緣將滑膜完整剪下，用眼科直鑷夾起置10%的中性甲醛中固定。同法取右側滑膜。

4 觀察項目

4．1 多發性關節炎指數評分

全身病變按5級評分法［3］進行評分，根據未注射佐劑的其余3個肢體的病變程度累計積分，計算出AI。0分:無紅腫;1分:小趾關節紅腫;2分:趾關節和足跖腫脹;3分:踝關節以下的足爪腫脹;4分:包括踝關節在內的全部足爪腫脹。把3個關節的積分累計起來，即為每只大鼠的AI，總分為0～12分。

4．2 滑膜組織TNF－α、IL－10表達檢測(RT－PCR)

1)提取總RNA;2)RNA逆轉錄;3)DNA聚合酶鏈反應(PCR);4)RT－PCR產物設計。

4．3 數據統計

5 結果

5．1 AA大鼠關節炎變化觀察

針灸可以改善AA大鼠多關節炎指數，而且調督通脈針灸法優于普通針灸法(見表1)。

表1 各組大鼠多發性關節炎指數變化比較(±s)

表1 各組大鼠多發性關節炎指數變化比較(±s)

注:與空白對照組比較，△P ＜0．05;與模型組比較，☆P ＜0．05，★P＜0．01;調督通脈針灸組與普通針灸組比較，※P＜0．05

組別 n 針灸前 針灸第7天 針灸第14天空白對照組(A)10 0±0 0±0 0±0模型組 10 9．5 ±1．581△ 8．2 ±1．751 6．4 ±1．163普通針灸組 10 9．3 ±1．494△ 6．7 ±1．059☆ 5．2 ±1．033☆調督通脈針灸組10 9．6 ±1．506△ 5．5 ±1．849★※ 4．2 ±1．023★※

5．2 滑膜組織mRNA的表達檢測結果

5．2．1 滑膜組織TNF－αmRNA表達變化

針灸能夠抑制AA大鼠關節滑膜高表達的TNF－amRNA活性，而且調督通脈針灸法優于普通針灸法(見表2)。

表2 大鼠滑膜TNF－amRNA相對表達水平比較(±s)

表2 大鼠滑膜TNF－amRNA相對表達水平比較(±s)

注:與空白對照組比較，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01;調督通脈針灸組與普通針灸組比較，※P＜0．05

組別n TNF－a空白對照組(A)10 0．134 2 ±0．005 2模型組(B) 10 0．741 8 ±0．010 1△普通針灸組(C) 10 0．475 3 ±0．006 5☆調督通脈針灸組(D) 10 0．243 6 ±0．037 6★※

5．2．2 滑膜組織IL－10mRNA表達變化

針灸能夠提高AA大鼠關節滑膜IL－10mRNA表達水平，而且調督通脈針灸法優于普通針灸法(見表3)

表3 大鼠滑膜IL－10mRNA相對表達水平比較(±s)

表3 大鼠滑膜IL－10mRNA相對表達水平比較(±s)

注:與空白對照組比較，△P＜0．01;與模型組比較，☆P ＜0．05，★P ＜0．01;調督通脈直灸組與普通針灸組比較，※P ＜0．05。

組別n IL－10空白對照組(A)10 0．5499 ±0．0157模型組(B) 10 0．1684 ±0．0354△普通針灸組(C) 10 0．3438 ±0．0185☆調督通脈針灸組(D) 10 0．5460 ±0．0162★※

6 討論

細胞因子是感染、炎癥和免疫性疾病的重要介質。許多細胞因子已被公認為是RA關節損傷和炎癥的重要介質，這些細胞因子參與RA的整個病理過程。與RA相關的細胞因子有 TNF－a、IL－10、IL－1、IL－2等，這些細胞因子對滑膜細胞分化、增殖、和分泌有調節作用。在RA的發病中，對炎癥過程有抑制或促進作用，其中與RA關系最為密切的細胞因子有TNF－a、IL－10 等［4－6］。在影響 RA 細胞因子的研究中，以腫瘤壞死因子倍受矚目。TNF－a在RA的發病機制中起到重要的作用。IL－10是近年來發現并克隆表達的一種細胞因子，具有很強免疫調控及免疫抑制作用，能抑制巨噬細胞和單核細胞的抗原遞呈功能，從而抑制多種促炎性細胞因子的產生［7］，在RA的發病中起著一定作用。IL－10能增加RA抗炎因子并減少RA致病性促炎因子。

有研究表明，針灸具有調節機體免疫功能的作用［8］。本研究以調督通脈針灸法為研究方法，其是以貫通督脈之陽氣，疏通四肢之經脈為法則，達到調和陰陽，平和氣血的目的。本實驗研究發現，此法可降低滑膜組織TNF－a表達和增高IL－10的表達，通過調節上述細胞因子的表達，表現出雙向調節作用，使免疫功能的失衡得到了較好的調整。這可能是在分子水平針灸治療RA的機制之一。

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