正交法優化槐米中蘆丁的超聲提取工藝

付起鳳，王德娟，孟凡佳

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

槐米(Flos Sophorae)為豆科植物槐(Sophora japonica L)的干燥花及花蕾，該藥性微寒、味苦，具有涼血止血，清肝瀉火的功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈［1］。藥理研究表明，槐米中所含主要成分為蘆丁(Rutin，維生素P)，又稱蕓香苷，蘆丁難溶于冷水(1∶8 000)，略溶于沸水(1∶200)。本實驗是根據蘆丁在冷水和熱水中的溶解度差異較大的特性，以槐米為原料，采用超聲法進行提取，用空氣冷凝回流法進行精制。用高效液相色譜法測定蘆丁的含量。通過正交設計法對超聲提取時間、提取溫度、提取頻率進行三因素三水平試驗，以此來確定超聲法提取槐米中蘆丁的優良工藝。

1 儀器與試藥

LC－2010AHT高效液相色譜分析儀(日本島津);KQ－500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHB－IIIB循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DHG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);AB204－N型萬分之一電子天平(Metter Toledo CORPORATION);槐米藥材(購于哈爾濱寶豐藥店);蘆丁對照品(購于中國藥品生物制品有限公司);甲醇為色譜純;冰醋酸為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2．1 槐米中蘆丁的提取方法

向500ml的燒杯中加400ml蒸餾水，在電爐子上加熱至沸騰，緩緩加入20．0g槐米粗粉并不斷攪拌，繼續煮沸2min，然后將燒杯轉移到超聲清洗器中進行超聲提取后，靜置，取上層絮狀物抽濾，并干燥后得粗品蘆丁，將該產物于100ml圓底燒瓶中并加入15～20ml甲醇進行回流冷凝40min，趁熱過濾得濾液，將其放冷至結晶完全后過濾得精品蘆丁，將其于105℃干燥至恒重得干燥的精品蘆丁。

2．2 色譜條件

固定相:Hypersil ODS2 C18色譜柱(4．6mm×150mm，5μm);保護柱(大連物化所 依特利公司);流動相:甲醇－1%冰醋酸(40∶60V/V)溶液，應用前經0.45μm微孔濾膜過濾，并超聲脫氣;流速:1．0ml/min;檢測波長為257nm;進樣量為10ml;柱溫為30℃。該色譜條件的對照品及樣品的色譜圖見圖1，圖2。

2．3 標準曲線的制備

取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品50．0mg于50ml容量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1mg/ml的溶液，作為儲備液。分別取適量儲備液加入色譜甲醇配制成 5，10，25，100，150，300μg/ml的蘆丁色譜甲醇溶液。按前述色譜條件取10μl進樣，測定峰面積。以濃度X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，見表1。結果如圖3所示。

表1 標準曲線的繪制(±s)

表1 標準曲線的繪制(±s)

濃度(μg/m l)5 10 25 100 150 300峰面積(A)79 336 158 752 426 871 1 726 4662 565 101 5 387 017

并以Y對X進行線性回歸，得回歸方程Y=17 921．171 6X －38 324．711 3 r=0．999 7。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

表2 精密度實驗結果

表3 重復性考察結果

圖3 標準曲線圖

通過回歸方程和標準曲線可以看出，蘆丁對照品在5～300μg/ml濃度范圍內，其峰面積與濃度成良好的線性關系。

2．4 樣品的測定

對照品溶液的配制:取上述貯備液5ml，加入色譜甲醇至50ml并搖勻，使配制成濃度為100μg/ml的蘆丁溶液。

供試品溶液的配制:取樣品5．0mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解并稀釋至50ml，制成每1ml含100μg蘆丁的溶液，用微孔濾膜過濾，直接進樣，用外標法測定。

2．4．1 儀器精密度實驗

取蘆丁對照品溶液(濃度為100μg/ml)，選用同一色譜條件及同一進樣量(10μl)，重復進樣5次，測定供試品的峰面積(S)，計算其精密度的RSD%。其峰面積(S)和保留時間的相對標準偏差分別為0.28%(＜1．5%)、0．77%(＜1．5%)。儀器精密度良好。

2．4．2 重復性實驗

分別取3份槐米藥材粗粉約20．0g，精密稱定，按樣品4的條件提取，再依供試品溶液的制備方法操作，得3份供試品溶液，隨行蘆丁對照品(濃度為100μg/ml)溶液作對照，在波長257nm處測峰面積值，計算RSD為2．53%。重復性較好。

2．5 正交試驗考察提取工藝

2．5．1 正交試驗設計

根據單因素試驗及超聲清洗器的功能范圍，本實驗選擇固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(2次)，考察影響槐米中蘆丁的超聲提取工藝的主要影響因素范圍，即提取溫度為80℃、70℃、60℃，提取時間為10min、20min、30min，提取功率為200W、300W、400W，據此選用 L9(34)正交試驗設計［2］，見表4。

2．5．2 正交試驗與結果分析

2．5．2．1 正交試驗

取槐米藥材粗粉20．0g，精密稱定，按照上述槐米中蘆丁的提取方法進行提取，再依供試品溶液的制備方法操作，按L9(34)正交表設計方案進行試驗，用高效液相色譜法對槐米提取物中蘆丁進行含量測定［3］。見表5。

表4 L9(34)正交試驗因素水平表

表5 L9(34)正交試驗表

表6 正交試驗方差分析

2．5．2．2 結果分析

根據方差分析結果可知，以槐米中提出蘆丁的百分含量為指標，槐米在以水為溶劑用超聲法進行提取時，各個因素對槐米提取效果的影響程度不同。直觀分析顯示，溫度是影響蘆丁提取量的主要因素，其次為提取功率;方差分析結果表明，提取溫度具有顯著性差異，且各因素的影響程度依次為A＞C＞B，所以對提取效果影響有統計學意義的因素是提取溫度A。因此超聲法提取槐米中蘆丁較理想的提取工藝方案是A2B2C3，即在固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(2次)的條件下，提取溫度為70℃，提取時間為20min，提取功率為400W時，提取效果最佳。

3 討論

本實驗以槐米為研究對象，考察了以水為溶劑，采用超聲提取法來提取槐米中蘆丁成分，并以槐米中提取出蘆丁百分含量為評價指標，以蘆丁為對照品，采用高效液相色譜法測定提取蘆丁的含量;并利用正交試驗的方法來優選出提取槐米中蘆丁的最佳工藝。經查閱文獻，確定出槐米中蘆丁提取工藝的主要影響因素可以包括為提取溫度、提取時間、提取功率及提取頻率等多個因素，根據實際情況選用了前三個因素，并采用L9(34)正交試驗表，進行了多次試驗，最后綜合結果分析，得到超聲法提取槐米中蘆丁的最佳工藝，即在固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(2次)的條件下，提取溫度為70℃，提取時間為20min，提取功率為400W時，提取效果最佳。為優化槐米中蘆丁的超聲法水提取工藝提供了參考依據。

用超聲法提取槐米中的蘆丁時，適宜的超聲提取條件可提高蘆丁的產率。優選出的提取工藝條件簡單易行、提取速度快，節省了提取時間，提高了實驗效率。

由于該實驗所用的超聲清洗器功能有限，所選擇的條件范圍受到了限制，槐米中蘆丁的提取率不是很理想，但在實驗室現有的條件下該實驗確實對槐米中蘆丁的超聲提取工藝起到了優化作用;如果將超聲清洗器改為超生提取器，我們就可以考察更多的試驗因素，并且每個因素也可以通過單因素考察法確定出更好的實驗水平范圍，再通過正交設計試驗優選出提取率更佳的實驗方案。

［1］馬雙成．中國藥典［S］．北京:人民衛生出版社，2010:333．

［2］經明，王宏，曾祖平，等．正交試驗篩選心衰顆粒提取工藝的研究［J］．中國實驗方劑學雜志，2008，14(8):29 －31．

［3］鄧富良，陳本美，陳國華，等．高效液相色譜法測定槐米中的蘆丁含量［J］．湖南醫科大學學報，2005，25(6):598－600．