豬繁殖與呼吸障礙綜合征檢測方法的研究進展

錢根林 樊彥紅 潘冬春

（1.吳江市畜牧獸醫站，吳江 215200；2.吳江市松陵動物防疫站，吳江 215200）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱豬高致病性藍耳病，由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）感染所致。該病在中國的流行和分布十分廣泛，危害日趨嚴重，成為威脅豬場的以繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病，目前該病已存在于世界上所有養豬的國家及地區，且一般與圓環病毒等混合感染，已成為對養豬業具有重大危害的動物疫病，由于目前尚無有效藥物可對PRRS病豬進行治療，在臨床上主要是依靠注射PRRSV的疫苗對易感動物進行免疫，然后定期對抗體進行監測并根據監測結果制訂相應的免疫措施的方法對本病進行預防。本文簡要介紹了PPRS檢測方法的研究概況。

1 PRRSV病原的檢測

針對PRRSV的病原進行的檢測，主要是靠分離PRRSV，然后進行細胞培養和病毒鑒定。目前報道的用于培養PRRSV的細胞有豬肺巨噬細胞（PAM）、MA104 細胞系的克隆株Marc-145 及HS2H 細胞、CL2421 細胞[1-2]。PAM對PRRSV有較高的敏感性，大多數毒株均適應該細胞，特別是歐洲毒株，且產毒量高。但由于PAM存在豬肺原性病原體的污染，制備的技術難度大，難以獲得均質的PAM等問題，應用受到限制。Marc-145 細胞在接種后4～7 d出現細胞呈灶狀變圓，膨大之后皺縮脫落成灶狀空洞，病料以血清和肺組織樣本分離率為最高，血清樣本最為方便。用HS2H細胞作為PRRSV分離用細胞，具有較高的敏感性，細胞病變典型，并且由于它是傳代細胞系，制備簡單，容易獲得，適宜于一般實驗室培養、分離PRRSV。

2 PRRSV的血清學檢測

血清學檢測技術主要包括免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫膠體金技術、間接免疫熒光試驗（IFA）和血清中和試驗（SN）等。血清學檢測技術因操作簡便，且敏感性和特異性較高，已成為豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要檢測方法之一。

IPMA是PRRS抗體檢測的重要方法之一。此法敏感性和特異性都比較好。可用于PRRSV的抗原檢測、病毒鑒定及血清抗體檢測。Wensvoor等建立的IPAM檢測PRRS抗體至今仍是歐洲常用的檢測手段[3]。IPMA具有特異性，敏感性結果與IFA相似。但此法在判定上有主觀性，且費時，檢測價格貴。血清中和試驗（SN）檢測PRRS 抗體特異性高，但因PRRS中和抗體出現晚而不適宜于早期診斷。Yoon等[4]人通過添加20%新鮮豬血清或豚鼠血清提高補體含量對SN 法進行改良，能夠檢出感染后的9～11 d的抗體。PRRS中和抗體持續時間可長達6個月，此法可用于PRRS后期診斷和區分PRRSV毒株。

酶聯免疫吸附試驗因其條件要求低，操作簡單，穩定性好，特異性敏感性高適用于基層獸醫工作，現已被廣泛應用于PRRSV抗體檢測。建立此項診斷技術的關鍵在于病毒的細胞培養和病毒作為ELISA 抗原的純化處理。Cho 等[5]應用Triton- X100 制備獲得高純度的ELISA 抗原，輔以高效封閉試劑，使該法具有高特異性、高敏感性和快速經濟的特點。此法優于IMAP，被廣泛應用于生產中PRRSV抗體的檢測。Seuberlich 等[6]報道了用競爭ELISA來檢測PRRSV，同時與間接免疫熒光試驗（IFA）和傳統ELISA技術進行比較，結果顯示其敏感性和特異性都很高，可以作為日常的診斷和監測方法。

免疫膠體金技術是近年來發展起來的快速診斷技術，目前已有商品化的膠體金試紙出售，該法操作簡單，診斷時間短，適合基層推廣使用，但是在基層使用中發現有假陽性和假陰性現象的出現，因此需要在檢測的靈敏度和準確度方面進行提高，滿足生產需要。

3 分子生物學診斷

PRRSV的分子生物學診斷技術包括：反轉錄PCR技術（RTPCR），核酸探針技術和DNA微陣列技術。

RT-PCR 是檢測PRRS的主要手段。其原理是擴增病毒特異而保守的基因片段，PRRSV 主要是擴增ORF7。RT-PCR提供了一種良好的可替代細胞培養檢測PRRSV 的方法。

Christopher 等[7]首先建立了檢測豬精液中PRRSV的RT-PCR方法，該方法快速、敏感、可靠、實驗接毒92 d后，仍可從豬精液中檢測病毒RNA。在RT- PCR 的基礎上發展起來的巢式PCR、定量Real-Time RT-PCR，巢式RT-PCR 均可用于PRRSV的檢測和定型，還提高了檢測的敏感性。

Sur 等[8]以PRRSV 的RNA為模板，通過RT-PCR 擴增ORF7 中的433 bp 片段，應用地高辛標記方法制備PRRSV 特異性cDNA 探針，建立了檢測PRRSV原位雜交技術，該法可在肺、淋巴組織、肺泡巨噬細胞（尸體剖檢后灌洗獲得）、淋巴結、腎臟的感染細胞內檢測到PRRSV 的RNA，較免疫組化具有更高的敏感性和特異性，特別適合感染后期的細胞內PRRSV的RNA的檢測。該方法不僅能夠證明豬體內確實存在有PRRSV，而且能夠對PRRSV 在體內器官中的動態分布情況進行追蹤檢測。

Lee 等[9]建立了基因芯片技術用于GP4 和GPS 對細胞基因表達影響的研究。以Hela 細胞系為PRRSV GP5 蛋白穩定的表達載體，應用免疫熒光技術、Western 雜交和免疫沉淀試驗均未觀察到細胞凋亡現象；同時還檢驗了Marc-145 細胞與HeLa 共同培養時GP5表達對Marc-145 細胞的影響也未發現凋亡現象的存在。使用細胞凋亡芯片檢測證實GP5 表達不能引起細胞凋亡，由于GP5 的表達與免疫反應有關，因此其表達譜能用于PRRVS的診斷。

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