我國分離的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析＊

解庭波，黃思佳，明平剛，吳 杰，徐葛林，嚴家新

我國分離的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析＊

解庭波，黃思佳，明平剛，吳 杰，徐葛林，嚴家新

目的探討我國狂犬病病毒P、M蛋白基因序列的結構特點及變異情況。方法用RT－PCR方法從分離的10株具有代表性的狂犬病病毒中獲得目的基因片段，測定核苷酸序列后，利用生物信息學軟件分析核苷酸、氨基酸序列及其相關的功能位點并構建P、M蛋白基因的系統發育樹。結果10株病毒P和M基因核苷酸序列同源性分別為85．9%～99．4%和89．5%～99．5%，推導出的氨基酸同源性分別為92．3%～100%和96．0%～99．5%。在核苷酸及氨基酸水平上，10株病毒與我國分離的街毒株HN10及CTN疫苗株的P、M基因同源性均明顯高于國外其它疫苗株、標準攻擊毒CVS株相應的同源性。系統發育分析表明，10株病毒與我國湖南街毒株、CTN疫苗株進化關系最近，而與研究中選取的其他毒株進化關系較遠。氨基酸對位分析表明，與其它基因1型毒株相比，本研究中10株狂犬病病毒的P、M基因出現多處變異，但很少在功能區發生變異。結論分離的10株病毒屬基因l型狂犬病病毒，與我國分離的街毒株及CTN疫苗株關系較近。

狂犬病病毒；遺傳特征；P基因；M基因

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）屬彈狀病毒科狂犬病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，病毒基因組長約12 kb，分為7個功能區，從3′至5′方向依次為3′非編 碼 區 （3′leader）－N－P－M－G－L－5′非 翻 譯 區 （5′trailer），分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和轉錄酶大蛋白（L）。研究表明，除G蛋白外，P蛋白和M蛋白也與狂犬病病毒的致病性相關［1］。P蛋白與N蛋白、L蛋白共同構成核糖核蛋白（RNP）包裹著病毒RNA，和L蛋白一起在病毒的轉錄和復制中發揮著重要作用［2］。此外，M蛋白決定了病毒的組裝和出芽［3］，即使在沒有其它病毒成份存在的情況下，仍然能夠從細胞中以出芽的方式釋放出來，而且能夠與病毒糖蛋白（G）相互作用使其整合到新生病毒中，參與宿主的免疫反應。近年來還發現M蛋白與宿主神經元的凋亡有關［4］。

隨著分子生物學的迅速發展，對狂犬病病毒分子結構的認識逐漸深入，但是在狂犬病毒遺傳變異方面的分析研究主要集中在N、G基因，而關于P、M基因序列的報道還較少。為了解我國狂犬病病毒P、M基因序列和結構特點，本研究選取我國在不同地域分離的10株狂犬病病毒，用RT－PCR方法擴增P、M基因編碼區序列并進行序列測定，通過與GenBank中具有代表性的狂犬病病毒及疫苗株的P、M基因序列信息在分子水平上進行同源性分析、主要功能位點比較和種系發生分析，探討中國狂犬病病毒P、M基因的遺傳特點、進化規律等分子生物學特征。

1 材料與方法

1．1 病毒毒株 從武漢生物制品研究所狂犬病檢測中心收集的街毒株中選取10個在地域上具有代表性的（不同的省份及地區）街毒株，其代碼及分離地區見表1。將以上毒株接種于1～2日齡乳鼠腦，取發病后死亡的腦組織用于RNA提取。

1．2 主要試劑 TRIzol購自Invitrogen公司，MMLV反轉錄酶為大連寶生物公司產品，Go Taq Green Mix DNA聚合酶購于Promega公司，凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購于QIAGEN公司。

1．3 引物設計 參考GenBank中收錄的多株狂犬病病毒序列，針對P、M基因的編碼區分別設計上、下 游 引 物。 序 列 如 下：M－F：CAGGCAACACCACTGATAAAATGAA；M－R：TCTCTCCTCCAGAGGTAAACAAGTG（擴增區域2476－3153 bp；預期長度678 bp），P－F：TAACACCCCTCCTTTT

GAACCAT；P－R：GTGGTGTTGCCTGTTTTTT

TCAT（擴增區域1484－2488 bp；預期長度：1005 bp）。兩對引物由南京金斯瑞公司合成。

1．4 病毒RNA的提取 取陽性腦組織100 mg，加入1 m L TRIzol充分研磨，然后用力振蕩混勻，室溫靜置5 min。加入氯仿250μL，振蕩混勻后室溫靜置5 min；4℃13 000 r／min離心15 min；將上清小心轉入新的1．5 m L離心管，加入等體積的異丙醇，混勻后置－20℃1 h。隨后，4℃13 000 r／min離心10 min；棄上清，加入1．2 m L 75%乙醇，在振蕩器上振蕩懸浮沉淀，4℃12 000 r／min離心10 min；小心棄上清，在超凈臺內吹干，加20μL DEPC水溶解RNA樣品。提取的RNA立即用于cDNA合成或－80℃凍存備用。

1．5 逆轉錄及P、M基因的擴增 以pd（N）6為引物，反轉錄合成病毒基因組cDNA。以此為模板PCR反應擴增P、M基因。PCR反應體系為：Go Taq Green Mix 25μL，去離子水21μL，cDNA模板2μL，濃度為10 pmol／μL的P、M 基因特異性上、下游引物各1μL。PCR循環參數為：94℃ 預變性5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，共30個循環；72℃延伸10 min。擴增后的基因片段經1%凝膠電泳鑒定，將鑒定后的PCR產物用凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit回收，回收后的PCR產物送南京金斯瑞公司測序。

1．6 DNA序列的測定及分析 利用ATGC軟件對測序結果進行拼接和手工校對；利用BioEdit軟件對序列文件進行剪切、拼接；使用DNAStar軟件包中的Meg Align模塊對基因所編碼的氨基酸進行對位分析；將測定的序列與GenBank中具有代表性的國內外狂犬病病毒街毒株及疫苗株（表1）的P和M基因核苷酸和氨基酸序列進行比對和分析，序列比對使用 Clustal X1．83；用 MEGA 4．1軟件以Kimura two－parameter模型鄰位相連法（NJ）構建基因的系統發育樹。

表1 本研究中使用的狂犬病病毒P蛋白和M蛋白基因序列Tab．1 P and M gene of rabies viruses used in this study

2 結 果

2．1 狂犬病病毒P、M基因擴增結果 10株狂犬病病毒P、M基因擴增片段分別為1 005 bp和678 bp左右，與預期大小相符，結果見圖1和圖2。

2．2 狂犬病病毒P基因測序結果及分析 序列分析表明，10株狂犬病病毒P基因完整開放閱讀框（ORF）全長均為894 bp，編碼長度為297個氨基酸殘基。10株病毒彼此之間核苷酸及氨基酸同源性分別在85．9%～99．4%和92．3%～100%之間。其中09ZH02與10GZ01核苷酸同源性最低（85．9%），10GS01與10GZ01核苷酸同源性最高（99．4%）。將這10株病毒的P基因核苷酸序列與國內外其他代表性街毒株和疫苗株的P基因核苷酸序列進行比較，核苷酸同源性在80．5%～93．4%，氨基酸同源性在84．2%～99．3%（表2）。將分離的10株病毒氨基酸序列進行比對，P蛋白與L蛋白主要作用區域的前19位氨基酸中，除了10GS01第3位氨基酸為E外，其余均一致。P蛋白與LC8相互作用位點的143～148位氨基酸中，除09ZH02第144位氨基酸為R外，其余序列均為DKSTQT。P蛋白63－64位和162、210、271位氨基酸殘基具有特定的蛋白激酶磷酸化絲氨酸位點，10株狂犬病病毒在這些位點的氨基酸均為P、S、S、S、S，與CTN株一致。利用核苷酸序列建立P基因NJ進化樹，見圖3。從進化樹分析，分離的10株狂犬病病毒P基因與我國湖南以往分離的街毒株HN10以及我國人用狂犬病疫苗株CTN有著較近的系統發育關系，處于同一個亞群。而國外的病毒株以及疫苗株在系統發育樹上構成另一個亞群。

2．3 狂犬病病毒M－基因測序結果及分析 序列分析表明，10株狂犬病病毒M基因完整開放閱讀框（ORF）全長均為609 bp，編碼長度為202的氨基酸殘基。10株病毒彼此之間核苷酸及氨基酸同源性分別在89．5%～99．5%和96．0%～99．5%之間。其中93JL01與10GS01核苷酸同源性最低（89．5%），09ZN01與10GZ01核苷酸同源性最高（99．5%）。將這10株病毒的M基因核苷酸序列與國內外其它代表性街毒株和疫苗株的M基因核苷酸序列進行比較，核苷酸同源性在82．3%～97%，氨基酸同源性在91．6%～99%（表2）。本研究中測定的10株狂犬病病毒M蛋白N端35～38位氨基酸殘基為高度保守的富含脯氨酸序列，即PPEY，與其他比較的毒株一致。M蛋白第58位氨基酸殘基對調整病毒轉錄和復制的平衡具有關鍵作用，10株病毒M蛋白的第58位氨基酸殘基均為谷氨酰胺殘基（E），顯示出高度保守性。利用核苷酸序列建立M基因NJ進化樹，見圖3。從進化樹分析，分離的10株狂犬病病毒M基因與我國湖南以往分離的街毒株HN10以及我國人用狂犬病疫苗株CTN有著較近的系統發育關系，處于同一個亞群。而國外的病毒株以及疫苗株在系統發育樹上構成另一個亞群。

3 討 論

本研究中我們從武漢生物制品研究所狂犬病檢測中心收集的121株街毒株中選取了10株。為了使選取的樣品具有代表性，在地域上我們選擇的是我國范圍內不同的省份及地區所分離的街毒株，包括像安徽、廣西、貴州這樣的狂犬病高發區。在時間跨度上，我們主要選擇的是近3年分離的狂犬病病毒，也包括1993年和1998年本中心收集到的比較早的街毒株樣品。另外從分離病毒的宿主中，我們既選擇了從狂犬病病毒的主要攜帶者——犬中分離的病毒，也選擇了白面鼬和鹿這樣的野生動物中分離的毒株。研究中，我們將以上收集的毒株接種于乳鼠腦，取發病后死亡的腦組織提取RNA、RT－PCR、序列測定和后續的序列分析。

表2 我國10株狂犬病病毒與代表性的街毒株和疫苗株P和M基因氨基酸序列同源性的比較（%）Tab．2 Comparison of amino acid sequences of P and M gene between 10 Chinese rabies viruses and the representative street strains and vaccine strains（%）

圖3 狂犬病病毒P和M基因系統發育樹Fig．3 The phylogenetic tree of RV P and M gene

通過同源性分析發現，10株病毒彼此之間P蛋白核苷酸及氨基酸同源性分別在85．9%～99．4%和92．3%～100%之間，M蛋白核苷酸及氨基酸同源性分別在89．5%～99．5%和96．0%～99．5%之間，均在文中參考的其它基因1型狂犬病毒彼此同源性范圍內，因此屬基因1型狂犬病病毒。從進化樹分析，分離的10株狂犬病病毒P基因和M基因與我國湖南以往分離的街毒株HN10以及我國人用狂犬病疫苗株CTN有著較近的系統發育關系，處于同一個亞群。而國外的病毒株以及疫苗株在系統發育樹上構成另一個亞群。

P蛋白是一個多功能型蛋白，一方面它與可溶性的N蛋白結合形成N－P蛋白復合物以防止N蛋白的自身聚合，保持N蛋白形成核衣殼時所需的最佳形式［5］。另一方面P蛋白作為一種非催化性的輔助因子，協同L蛋白參與病毒RNA的轉錄與復制。P蛋白的前19個氨基酸與L蛋白結合［6］以介導L蛋白的聚合酶活性中心與N－RNA復合物連接的方式參與基因組的表達［7］。本研究中10株病毒P蛋白前19位氨基酸中除了10GS01第3位氨基酸為E外，其余均一致。P蛋白139～172位區域能與胞漿內動力蛋白輕鏈（LC8）相互作用，LC8作為胞漿動力蛋白一部分，參與肌球蛋白V復合物的形成，驅動RV的逆軸漿運行［8］，本研究中10株病毒的P蛋白在143～148位含有高度保守序列，序列均為DKSTQT。此外，P蛋白具有多種磷酸化形式，其磷酸化主要由狂犬病病毒蛋白激酶（RVPK）和蛋白激酶C（PKC）完成，這種磷酸化狀態對其生物學功能的發揮具有重要作用。P蛋白氨基酸N端第63、64兩位絲氨酸殘基為RVPK作用位點，N端第162、210、271位絲氨酸殘基為PKC作用位點，本次分離的10株病毒這些磷酸化位點均未發生變異。

M蛋白作為一種連接蛋白，它將核衣殼（RNP）和病毒糖蛋白連接在一起，它可以直接影響糖蛋白在病毒包膜表面的構型，在病毒形態形成中起著重要作用。M蛋白的PT／SAP、PPPY、Yxx 3個基序是有效的晚期出芽結構域（L－Domains），位于35～38位膜序（PPPY或者PY）富含脯氨酸［9］，本次所測10株病毒序列該基序均是PPPEY。M蛋白對病毒轉錄具有負調控作用［10］，其中第58位氨基酸殘基對調整病毒轉錄和復制的平衡具有關鍵作用，10株病毒M蛋白的第58位氨基酸殘基均為谷氨酰胺殘基（E），顯示出高度保守性。

研究中我們在對本檢測中心分離的10株狂犬病病毒P、M基因序列進行比對和分析的基礎上發現，各株病毒之間在核苷酸和氨基酸序列中發生了一些位點的變異，但在重要的功能位點上還是比較保守，與我國以往分離的街毒株和現在人用疫苗株CTN株關系較近。這為我國開展狂犬病分子流行病學研究，分析流行株與疫苗株之間的關系，評價疫苗對流行株的預防保護作用奠定了基礎。

［1］Shimizu K，Ito N，Mita T，et al．Involvement of nucleoprotein，phosphoprotein，and matrix protein genes of rabies virus in virulence for adult mice［J］．Virus Res，2007，123（2）：154－160．

［2］Chenik M，Schnell M，Conzelmann KK．Mapping the interacting domains between the rabies virus polymerase and phosphoprotein［J］．J Virol，1998，72（3）：1925－1930．

［3］Mebatsion T，Weiland F，Conzelmann KK．Matrix protein of rabies virus is responsible for the assembly and budding of bulletshaped particles and interacts with the transmembrance spike glycoprotein G ［J］．J Virol，1999，73（1）：242－250．

［4］Kassis R，Larrous F，Estaquier J，et al．Lyssavirus matrix protein induces apoptosis by a TRAIL－dependent mechanism involving caspase－8 activation ［J］．J Virol，2004，78 （12）：6543－6555．

［5］Green TJ，Macpherson S，Qiu S，et al．Study of the assembly of vesicular stomatitis virus N protein：role of the P protein［J］．J Virol，2000，74（20）：9515－9524．

［6］Chenik M，Schnell M，Conzelmann KK，et al．Mapping the interacting domains between the rabies virus polymerase and phosphoprotein［J］．J Virol，1998，72（3）：1925－1930．

［7］Schoehn G，Iseni F，Mavrakis M，et al．Structure of recombinant rabies virus nucleoprotein－RNA complex and identification of the phosphoprotein binding site［J］．J Virol，2001，75（1）：490－498．

［8］Raux H，Flamand A，Blondel D．Interaction of the rabies virus P protein with the LC8 dynein light chain［J］．J Virol，2000，74（21）：10212－10216．

［9］Irie T，Licata J M，Mcgettigan J P，et al．Budding of PPx Y－containing rhabdoviruses is not dependent on host proteins TGS101 and VPS4A［J］．J Virol，2004，78（6）：2657－2665．

［10］Finke S，Conzelmann KK．Dissociation of rabies virus matrix protein functions in regulation of viral RNA synthesis and virus assembly［J］．J Virol，2003，77（22）：12074－12082．

Genetic analysis on P and M gene of 10 rabies viruses isolated in China

XIE Ting－bo，HUANG Si－jia，MING Ping－gang，WU Jie，XU Ge－lin，YAN Jia－xin
（Center for Rabies Diagnosis，Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan 430060，China）

In order to investigate the genetic characteristics of phosphoprotein（P）and matrix protein（M）genes of 10 representative rabies virus（RV）isolated in China，the P and M genes were amplified by RT－PCR，and then sequenced．The nucleotide and amino acid sequences and their functional positions were analysed by bioinformatics software．The phylogenetic trees were constructed based on the P and M genes．The 10 Chinese RV P and M gene nucleotide homology were 85．9%－99．4%and 89．5%－99．5%，and the deduced amino acid identity were 92．3%－100%and 96．0%－99．5%respectively．The ten isolates showed much higher homology with the street strain HN10 and CTN vaccine strain in China than with other vaccine strains and challenge virus standard（CVS）abroad on both nucleotide level and amino acid level．Phylogenetic analysis revealed that these 10 isolates were more closely related to the strain from Hunan Province and vaccine strain CTN than to other strains used in the study．Compared with other genotype 1 rabies viruses，multiple amino acid residues were substituted in P and M gene of the 10 isolates but rarely mutated in the functional regions．These 10 strains of rabies virus isolated in our study belong to genotype 1 and show close relationship to the street strain and vaccine strain CTN in China．

rabies virus；genetic analysis；phosphoprotein gene；matrix protein gene

R373．9

A

1002－2694（2012）03－226－04

＊國家高技術研究發展計劃 （863計劃）項目（2007AA02Z402）資助

嚴家新，Email：yanjx45＠163．com

武漢生物制品研究所狂犬病檢測中心，武漢 430060

2011－09－26；

2011－11－15