嬰幼兒疑似甲型H1N1重癥病例及門診流感樣病例中鼻病毒的檢測分析＊

于新芬，潘勁草，寇 宇，李品艷，葉 榕，周銀燕

2.溫州醫學院，溫州 325035

鼻病毒（rhinovirus，RV）在分類上屬小RNA病毒科，是一組單正鏈的RNA病毒。鼻病毒基因組約7.2kb，包括5′非編碼區，一個編碼衣殼蛋白（VP4、VP2、VP3、VP1）及7個非結構蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）的大的開放閱讀框，終止于3′UTR及聚合 A尾巴[1]。人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）現分為3個基因型：HRV－A 、HRV－B及最新發現的HRV－C。自2006年起，美國、澳大利亞、香港等地陸續在急性呼吸道感染病例中發現了HRV－C基因型，HRV－C與 HRV－A 及 HRV－B在氨基酸水平上具有53%～57%的一致性[2－3]。

鼻病毒除感染人，還可感染馬、牛等動物。人鼻病毒是引起人類病毒性呼吸道感染最常見的病原體，有120多個血清型。某些動物鼻病毒也能使人感染發病。鼻病毒可引起較大規模的暴發流行，引起哮喘、細支氣管炎及致命性肺炎，具有一定的死亡率[4－5]。HRV－C感染引起的肺炎、哮喘加重、喘息的嚴重性較其他2個亞型具有顯著性差異[6]。HRV在嬰幼兒呼吸道感染及發病率方面，歷史以來重視不夠。但隨著核酸檢測技術的發展，越來越多的研究表明，HRV已在嬰幼兒呼吸道感染中產生明顯的疾病負擔。

2009年甲型H1N1流感流行，很多疑似甲型H1N1重癥病例／危重病例病原學不明，本文對杭州市部分嬰幼兒疑似甲流重癥病例及門診流感樣病例進行了鼻病毒的檢測。鼻病毒5′端非編碼區（5′UTR）及衣殼蛋白編碼區VP2－VP4常用于鼻病毒的檢測及鑒定。本文對其5′UTR和／或VP2－VP4基因進行了比對分析，以了解鼻病毒在不同樣本中的感染、流行、分子進化及其他呼吸道病毒的合并感染情況，同時了解HRV，特別是 HRV－C在呼吸道感染病例重癥化中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源樣本 1組為由杭州市各醫院及各轄區縣疾控中心采集送檢的疑似甲流重癥病例246份[2009年11月至2011年3月；甲型H1N1流感重癥病例定義參考甲型H1N1流感診療方案（2009年第3版）]，采集標本共計246份，其中咽拭子225份，氣管吸取物14份，鼻咽吸取物7份，樣本均采集于甲型流感H1N1流行期。樣本2組為門診流感樣病例68份[2010年11月至2011年3月；流感樣病例定義參考全國流感監測方案（2010年版）]，來源于某兒童醫院流感監測點，為咽拭子，采集于甲型H1N1流感流行期。兩組樣本均采集于冬春季節的甲型H1N1流感流行期，年齡≤6歲。樣本儲存于－70。C冰箱。

1.2 試劑 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara），EX Taq酶（Takara），QIAGEN RNA 提 取 試 劑 盒，One Step PrimeScript○RRT－PCR Kit（Takara），QIAGEN DNA mini kit。

1.3 引物及探針 擴增引物及探針見表1，由大連Takara公司合成。

表1 引物及探針Tab.1 Primers and probes

1.4 核酸提取 使用QIAGEN DNA mini kit試劑盒提取病毒DNA，使用QIAGEN Rneasy mini提取試劑盒提取病毒RNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。最后將核酸溶解于50μL ddH2O中。

1.5 逆轉錄及PCR檢測

1.5.1 逆轉錄 使用 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）進行反轉錄反應，反應體系為：1μL 50ng／μL的6－mer隨機引物，1μL dNTP（10mmol／L each），8μL提取的 RNA，混勻置65。C5min，冰上迅速冷卻。再加入反應液：4μL 5×PrimeScript II Buffer，0.5μL RNase Inhibitor（40U／μL），1μL PrimeScript II RTase（200U／μL），ddH2O 4.5μL。30。C10min，42。C60min進行反轉錄反應，70。C15min滅活酶，置冰上冷卻。cDNA保存于－30。C冰箱。

1.5.2 鼻病毒5′UTR和 VP2－VP4編碼區的擴增

分別以DK001／DK004和VPF／VPR為引物進行PCR。25μL體系中加入1μL cDNA作為模板。PCR反應條件：95。C5min，95。C15s，50。C15 s，72。C60s，35 個循環。5′UTR和 VP2－VP4編碼區擴增產物長度分別為390bp和547bp。

1.5.3 腸道病毒擴增 以腸道通用引物探針（EVF、EVR、EVP）進行 PCR。對鼻病毒引物DK001、DK004擴增陽性的樣本，用腸道通用引物探針進行實時PCR擴增。PCR反應條件：50。C2 min；95。C2min；95。C15s，55。C30s，45個循環。于55。C檢測通道的熒光信號。

1.6 其他呼吸道病毒的檢測 為了解鼻病毒的合并感染情況，對鼻病毒陽性樣本進行了呼吸道合胞病毒（RSV），流感病毒（IV），腺病毒（AV），副流感（PIV）1－4型以及冠狀病毒（HCoV）（HKU1、OC43、229E、NL63），偏 肺 病 毒 （hMPV），博 卡 病 毒（HBoV）的篩查[10－12]。

1.7 基因測序 將鼻病毒5′端UTR及VP2－VP4編碼區擴增陽性的PCR產物送上海生工進行雙向測序，于NCBI上進行序列比對。

1.8 進化樹分析 測序結果用Clustal X和Mega4.1軟件進行拼接和分析。多序列比對使用ClustalW進行。

2 結 果

2.1 樣本的流感檢測情況 樣本1組中流感陽性率為32.5%（80／246），其中甲型 H1N1陽性樣本為73份，占流感陽性樣本的91.2%（73／80），B型流感陽性樣本為7份。樣本2組中流感陽性率為30.8%（21／68），其中甲型 H1N1陽性為16份，B型流感陽性為1份，H3N1流感陽性為4份。

2.2 鼻病毒的檢測結果及分析 使用引物DK001及DK004擴增鼻病毒5′UTR，樣本1組中23份為陽性，樣本2組中16份為陽性。由于該對引物可以擴增出一些腸道病毒[7]，因此使用腸道通用引物探針對以上39份陽性樣本進行檢測，其中樣本1組中2份為腸道病毒陽性。樣本2組中5份為腸道病毒陽性。

本研究同時對鼻病毒5′UTR和／或VP2－VP4編碼區進行了序列測定，成功測序14份樣本；同時我們也對檢測出的腸道病毒進行了測序，成功測序6份樣本。測序鑒定結果見表2。經NCBI BLAST比對，該測序結果與核酸檢測結果完全對應。對于鼻病毒的鑒定，使用引物DK001及DK004擴增5′UTR后，對陽性樣本進行腸道病毒檢測，腸道病毒檢測陰性的樣本即為鼻病毒陽性。1組樣本鼻病毒陽性率為8.54%（21／246），2組樣本鼻病毒陽性率為16.2%（11／68）。

本研究中12份樣本對鼻病毒的5′UTR及VP2－VP4片段均進行了測序。該部分樣本的5′UTR測序鑒定結果與VP2－VP4測序鑒定結果具有完全一致性。由呼吸道咽拭子樣本中鑒定出的腸道病毒主要包括Echo09、柯薩奇A6、柯薩奇A10、柯薩奇B3等腸道病毒，見表2。4份樣本檢出HRV－C陽性，其中樣本1組1份陽性，年齡6M，該樣本同時合并感染甲型H1N1；樣本2組中3份陽性，年齡分別為3M、13M、19M，無合并感染。

2.3 各年齡段HRV的檢出情況 在樣本1組中，21例陽性病例中年齡最小50d，最大6歲。1歲以下檢出率最高，占HRV總陽性病例的47.6%。隨著年齡的增大HRV檢出率有所降低。樣本2組中，11份陽性病例中年齡最小3個月，最大6歲。1歲以下陽性病例占總陽性病例的54.5%。經過χ2檢驗，P＞0.05，樣本1組和樣本2組各年齡段的檢出情況之間沒有統計學差異。各年齡組檢出情況見表3。

2.4 鼻病毒進化樹分析 VP2－VP4擴增片段為547bp，對其內的430bp（EF173417，615－1044）進行了比對分析。使用Clustal X和Mega4.1軟件進行拼接和進化樹分析。結果見圖1。

圖1 鼻病毒VP2－VP4進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of HRV strains based on analysis of VP2－VP4

表2 測序鑒定結果表Tab.2 Sequencing results

表3 二組樣本各年齡段HRV的檢測情況Tab.3 HRV detection analysis between the two groups according to age

通過與參考序列比對，樣本09－9、09－109、09－119、10－120、09－D37、09－D60、10－919、10－921 為HRV－A基因型，各樣本間的核苷酸序列一致性為60%～98%。09－54為 HRV－B基因型。09－D49、10－846、10－850、11－B3為 HRV－C基因型，各樣本間的核苷酸序列一致性為67%～73%。10－896雖然只進行了5′UTR測序，但經BLAST比對為HRVA基因型。在14份成功進行HRV測序的樣本中，HRV－A、HRV－B、HRV－C基因型所占比例分別為64.3%、7.1%和28.6%。

本研究測序的HRV樣本中，對430bp（EF173417，615－1044）進行了多序列比對分析，HRV－A、HRV－B間的核苷酸序列一致性為58%～62%，HRV－A、HRV－C間的核苷酸序列一致性為58%～65%，HRV－B、HRV－C間的核苷酸序列一致性為55%～58%。

2.5 鼻病毒合并感染情況分析 對鼻病毒陽性樣本進行了呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（IV）、腺病毒（AV）、副流感（PIV）1－4型以及冠狀病毒（HCoV）（HKU1、OC43、229E、NL63）、偏肺病毒（hMPV）、博卡病毒（HBoV）的篩查。樣本1組和樣本2組的合并感染率分別為71.4%（15／21）、9.09%（1／11）。經過χ2檢驗（Fisher確切概率法），發現兩組樣本的合并感染情況在0～1和～6歲年齡組間均有統計學差異（P＜0.05）。與鼻病毒合并感染最多的是甲型H1N1流感，其次是RSV。結果見表4。

表4 兩組樣本鼻病毒陽性中合并其他病毒感染情況分析Tab.4 Analysis on the coinfection for HRV with the other respiratory viruses

3 討 論

國內對HRV的感染情況研究較少。趙林清[13]、江文輝[14]等分別對北京、廣州地區的兒童急性呼吸道感染中病例中進行鼻病毒的檢測及分析，但均未進行HRV－C檢測分析。Xiang Z等[15]從下呼吸道感染兒童病例中檢測到 HRV－C型（14／258），且具有較高的合并感染率（8／14）。Jin Y等[8]也從急性呼吸道感染病例樣本中檢測到HRV－C型（19／406）。2009年甲型H1N1流感流行，很多疑似甲型H1N1重癥病例／危重病例病原學不明，本文對杭州市部分嬰幼兒疑似甲流重癥病例及門診流感樣病例進行了鼻病毒的檢測。

鼻病毒具有120多個血清型，核酸序列變異較大。Kiang D等報道[7]，據鼻病毒5′UTR 310bp，對102個不同血清型鼻病毒的兩兩核酸變異性分析表明，核酸變異范圍為0.3%～63.3%。本研究對VP2－VP4的430bp的序列進行兩兩比對，HRV在該段的核苷酸序列一致性為55%～98%。HRV核酸序列變異大，使用實時熒光RT－PCR的方法進行檢測難度較大。本研究參考Kiang D等報道的引物DK001／DK004擴增5′端非編碼區可檢測到所有的鼻病毒，但因為鼻病毒和腸道病毒具有較近的親緣關系，該套引物同時也擴增出部分腸道病毒。鑒于鼻病毒與腸道病毒較近的親緣關系，有些研究將鼻病毒和腸道病毒的檢測一起進行分析[11]。本研究對DK001／DK004擴增陽性的樣本再使用腸道通用引物探針進行檢測，腸道病毒檢測陰性的樣本即為鼻病毒陽性。該結果與20份樣本的的測序鑒定結果完全一致。同時經測序分析，檢測到Echo09、柯薩奇A6、柯薩奇A10、柯薩奇B3等腸道病毒，說明腸道病毒在呼吸道感染中的復雜性和多樣性。

本文的鼻病毒分型結果為 HRV－A、HRV－B、HRV－C基因型所占比例分別為64.3%、7.1%和28.6%。樣本1組中 HRV－A、HRV－B、HRV－C基因型所占比例分別75%、12.5%、12.5%。樣本2組中 HRV－A、HRV－B、HRV－C基因型所占比例分別50%、0%、50%。總的來說，杭州嬰幼兒疑似甲流重癥病例及門診流感樣病例中HRV主要是以HRV－A、HRV－C基因型為主，HRV－B基因型相對較少。且HRV在疑似甲流重癥病例中主要是以合并感染為主，合并感染率高達71.4%，且有1份是與B型流感及PIV1的三重感染。鼻病毒在疑似甲流重癥病例的感染中多以合并感染為主，說明病毒合并感染在疑似甲流重癥病例中的復雜性，也提示可能鼻病毒在病例的重癥化中起到一定的作用。

HRV－C型是近年新發現的基因型，HRV－C病人的主要癥狀，有的僅表現為流感樣病例癥狀，有的則引起支氣管炎、肺炎、呼吸困難、哮喘加重、危及生命等[2－3]。本文共鑒定出4株 HRV－C型鼻病毒，1株來源于樣本1組，是與甲型H1N1病毒合并感染。另外3株來源于樣本2組，無合并感染，表現為流感樣病例。本研究對VP2－VP4其中430bp進行分析比對，4個 HRV－C型樣本中與 HRV－A 及HRV－B相比均有連續6個堿基的缺失。

Huang T等在 HRV－C中發現大量多重重組[1]，HRV－A 和 HRV－C共感染可能是產生病毒重組的原因。鼻病毒重組能力將導致極大的病毒多樣性，從而使鼻病毒診斷和檢測更加困難。鼻病毒血清型多、基因變異大、且難以培養等原因，其部分血清型引起的嚴重的臨床癥狀與發病模式之間的流行病學資料較少，有待于進一步深入研究。

[1]Huang T，Wang W，Bessaud M，et al.Evidence of recombina－tion and genetic diversity in human rhinoviruses in children with acute respiratory infection[J].PLoS One，2009，4（7）：e6355.

[2]Lau SK，Yip CC，Tsoi HW，et al.Clinical features and complete genome characterization of a distinct human rhinovirus（HRV）genetic cluster，probably representing apreviously undetected HRV species，HRV－C，associated with acute respiratory illness in children[J].J Clin Microbiol，2007，45（11）：3655－3664.

[3]McErlean P，Shackelton LA，Lambert SB，et al.Characterisation of a newly identified human rhinovirus，HRV－QPM，discovered in infants with bronchiolitis[J].J Clin Virol，2007，39（2）：67－75.

[4]Louie JK，Yagi S，Nelson FA，et al.Rhinovirus outbreak in a long term care facility for elderly persons associated with unusually high mortality[J].Clin Infect Dis，2005，41（2）：262－265.

[5]Hicks LA，Shepard CW，Britz PH，et al.Two outbreaks of severe respiratory disease in nursing homes associated with rhinovirus[J].J Am Geriatr Soc，2006，54（2）：284－289.

[6]Lau SK，Yip CC，Lin AW，et al.Clinical and molecular epidemiology of human rhinovirus C in children and adults in hong kong reveals a possible distinct human rhinovirus C subgroup[J].J Infect Dis，2009，200（7）：1096－1103.

[7]Kiang D，Kalra I，Yagi S，et al.Assay for 5＇Noncoding region analysis of all human rhinovirus prototype strains[J].J Clin Microbiol，2008，46（11）：3736－3745.

[8]Jin Y，Yuan XH，Xie ZP，et al.Prevalence and clinical characterization of a newly identified human rhinovirus C species in children with acute respiratory tract infections[J].J Clin Microbiol，2009，47（9）：2895－2900.

[9]嚴菊英，盧亦愚，徐昌平，等.腸道病毒TaqMan熒光定量RTPCR法快速檢測[J].中國公共衛生，2007，23（7）：818－820.

[10]Yu XF，Pan JC，Ye R，et al.Preparation of armored RNA as a control for multiplex Real－Time Reverse Transcription－PCR detection of influenza and severe acute respiratory syndrome coronavirus[J].J Clin Microbiol，2008，46（3）：837－841.

[11]Raymond F，Carbonneau J，Boucher N，et al.Comparison of automated microarray detection with Real－Time PCR assays for detection of respiratory viruses in specimens obtained from children[J].J Clin Microbiol，2009，47（3）：743－750.

[12]Damen M，Minnaar R，Glasius P，et al.Marjolein Damen.Real－Time PCR with an internal control for detection of all known human adenovirus serotypes [J].J Clin Microbiol，2008，46（12）：3997－4003 .

[13]趙林清，錢淵，朱汝南，等.北京地區2002－2006年急性呼吸道感染兒童中鼻病毒感染的研究[J].中華流行病學雜志，2007，28（7）：683－685.

[14]江文輝，陳羿，張瑩瑩，等.廣州地區兒童急性呼吸道鼻病毒感染的臨床研究[J].中國兒童保健雜志，2008，16（4）：418－419.

[15]Xiang Z，Gonzalez R，Xie Z，et al.Human rhinovirus group Cinfection in children with lower respiratory tract infection[J].Emerg Infect Dis，2008，14（10）：1665－1667.