幽門螺桿菌唾液酸結合黏附素（SabA）的克隆表達＊

李冬宏，宮雅楠，肖 迪，周南進，謝 勇，張建中

幽門螺桿菌唾液酸結合黏附素（SabA）的克隆表達＊

李冬宏1，2，宮雅楠1，肖 迪1，周南進2，謝 勇3，張建中1

目的構建幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡稱H．pylori或Hp）唾液酸結合黏附素（sialic acid－binding adhesion，Sab A）的重組質粒，并在大腸桿菌BL21中表達，為探討Sab A的功能及相關疫苗的發展提供幫助。方法以Hp 26695株基因組為模板，設計sabA基因特異性引物擴增目的基因，將PCR產物插入到pGEX－4T－1載體構建重組質粒，在大腸桿菌BL21中誘導表達。表達蛋白經飛行質譜鑒定，并用免疫印跡法評價其抗原性。結果經SDS－PAGE和飛行質譜鑒定，該表達蛋白為Hp外膜蛋白Sab A，經免疫印法跡檢測具有良好的抗原性。結論成功克隆了Hp的Sab A，并能在大腸桿菌BL21中表達，該蛋白具有良好的抗原性。

幽門螺桿菌；唾液酸黏附素；基因克隆；表達

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori或Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤的發病密切［1－3］。Hp的定植是致病的前提，而黏附素對其定植有著至關重要的作用。唾液酸結合黏附素（sialic acidbinding adhesion，Sab A）是新近發現的一種黏附素，它又稱Hp外膜蛋白17（outer membrane protein，OMP17），在Hp致病中起著重要作用，它與胃黏膜萎縮、腸上皮化生和胃癌的發生密切相關［4］。本研究擬構建sab A重組質粒，并對表達的Sab A進行初步探討，為后續致病機理研究和以其為靶點的Hp疫苗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材料 Hp 26695菌株及表達質粒p GEX－4T－1為中國疾病預防控制中心傳染病所診斷室（傳染病預防控制國家重點實驗室）保存；大腸桿菌BL21、瓊脂糖、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶Bam HⅠ、XhoⅠ、Ta KaRa LA Taq酶、1 kb DNA Ladder Marker、T4DNA連接酶均購自Ta KaRa公司；QIAamp DNA Mini Kit購自QIAGEN公司。1．2 方法

1．2．1 基因組和表達質粒的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit和質粒小提試劑盒的操作方法，提取Hp 26695菌株的基因組和表達質粒p GEX－4T－1。

1．2．2 目的基因的擴增 根據 GenBank（ID：899697）中Hp 26695菌株omp17基因序列，利用Primer Premier 5軟件設計特異性引物，并在5′端加入合適的內切酶位點，引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：

上游引物ATGGATCCAGCGCCGGCTATCAAATCG，

下游引物CGCTCGAGTCAGTAAGCGAACACATAATTGAGATA

上下游引物分別加入的酶切位點為Bam HⅠ、XhoⅠ。采用聚合酶鏈反應（PCR）以Hp 26695菌株基因組為模板擴增sabA基因片段，其反應條件為：預變性95℃10 min、變性95℃1 min、退火55℃1 min、延伸72℃2 min、終延伸72℃5 min，35個循環。所獲PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，進行瓊脂糖凝膠DNA回收，其方法按試劑盒操作。1．2．3 pGEX－4T－1／sab A重組質粒的構建 取回收后的PCR產物和提取的表達質粒進行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切反應，瓊脂糖凝膠鑒定后回收。后將回收產物進行連接反應，其中PCR產物與p GEX－4T－1比例為1∶3，金屬浴16℃過夜連接，連接產物轉化至E．coli BL21后，并涂布于含有氨芐青霉素（100μg／m L）的LB固體培養基上培養過夜，其詳細方法參見《分子生物學實驗指南》［5］。

1．2．4 重組質粒的鑒定 挑取單克隆菌落，提取質粒做質粒PCR，然后用限制性內切酶Bam HⅠ、XhoⅠ30℃酶切1 h后再37℃酶切3 h，鑒定重組質粒是否構建成功。

1．2．5 誘導表達及表達產物的SDS－PAGE經鑒定成功的陽性克隆株在LB液體培養基中37℃培養過夜，然后按照1∶100轉接至含氨芐青霉素的LB培養基中，繼續培養至OD600值為0．6～0．8時，加入終濃度為1．0 mmol／L的IPTG，誘導4 h。收集菌液，將菌液用PBS清洗，離心棄上清，再加入30 μLPBS和10μL蛋白上樣緩沖液煮沸10 min后進行12%SDS－PAGE分析。

1．2．6 飛行質譜鑒定 誘導表達產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后，在凝膠的相應位置切下表達蛋白條帶，按照飛行質譜樣制備操作流程制備質譜樣，然后經過4700 MALDI－TOF－MS蛋白質組分析系統分析鑒定是否為Sab A。

1．2．7 免疫印跡 將誘導表達菌樣品進行SDSPAGE，再轉到0．45μm的PVDF膜上，用抗 Hp 26695全菌蛋白免疫兔血清（1∶100稀釋，抗體由中國疾病預防控制中心傳染病所診斷室制備）室溫孵育3 h，再用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h，用DAB顯色。

2 結 果

2．1 sabA基因的擴增 以Hp 26695基因組DNA為模板進行目的基因擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到一條大小約1 890bp的片段，與目的基因的大小相符（圖1）。

圖1 PCR產物凝膠電泳分析1：1 kb DNA Ladder Marker；2：陰性對照；3：PCR 擴增sabA產物Fig．1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products 1：1 kb DNA Ladder Marker；2：negative control；3：sab A of PCR products

2．2 重組質粒的酶切鑒定 將重組質粒p GEX－4T－1－sab A經Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后1%凝膠電泳鑒定，得到兩條目的條帶，大小分別約為4 969bp（p GEX－4T－1）和1 890bp（sabA），符合預期結果（圖2），證明重組質粒構建成功。

2．3 誘導表達產物的SDS－PAGE和飛行質譜鑒定包含重組質粒p GEX－4T－1－sab A的菌株經誘導后進行12%SDS－PAGE，發現在90 k D附近出現大量表達蛋白條帶，與預計大小95 k D（含GET標簽蛋白26 k D）相比稍微偏小（圖3），切下該處的蛋白條帶按質譜樣制作標準流程制備質譜樣，經飛行質譜分析，為Hp外膜蛋白17（表1），表明該重組質粒在E．coli BL21中成功表達Sab A。

2．4 免疫印跡 將12%SDS－PAGE分離的蛋白樣轉移至PVDF膜上，Western blot結果顯示在95k D附近出現了一條特異性條帶，且條帶位置與SDSPAGE圖中目的條帶位置一致，說明表達蛋白具有良好的抗原性（圖4）。

圖2 重組質粒pGEX－4T－1－sabA雙酶切電泳圖1：重組質粒pGEX－4T－1－sab A雙酶切樣品；2：重組質粒pGEX－4T－1－sab A樣品；3：1 kb DNA Ladder MarkerFig．2 Identification of recombinant plasmid pGEX－4T－1／sabA by restricted endonuclease enzymes 1：Digested by Bam HⅠand XhoⅠ；2：Recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A；3：1 kb DNA Ladder Marker

圖3 誘導表達產物SDS－PAGE圖1：重組質粒pGEX－4T－1－sab A未誘導樣品；2：重組質粒pGEX－4T－1－sab A誘導樣品；3：空pGEX－4T－1誘導樣品；4：E．coli BL21未誘導樣品；5：E．coli BL21誘導樣品；6：蛋白 MarkerFig．3 SDS－PAGE analysis of Sab A recombinant protein expressed in BL21 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A before induction；2：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；3：plasmid p GEX－4T－1 induction with IPTG；4：E．coli BL21 before induction；5：E．coli BL21 induction with IPTG；6：molecular mass marker

表1 誘導表達蛋白飛行質譜鑒定結果Tab．1 Identification of SabA recombinant protein by time－of－flight mass spectrometry

3 討 論

Hp粘附于人胃黏膜必須有特異的黏附素和相應受體，Hp的黏附素目前已知有二十多種，但受體明確的不多［6］。2002年Jafar等［7］在研究 CCUG 17875突變株時，意外發現CCUG 17875 bab A2突變株能與感染Hp的胃炎病人的胃黏膜結合，從而發現了一種新的黏附素Sab A，它能夠特異性地與胃黏膜上皮細胞表面的唾液酸化的路易斯（sialyl－Lewis X／A，s LeX／A）抗原結合，并對sab A 陽性菌株的定植起著重要作用［8］。在Hp感染初期，Bab A與Leb血型抗原結合有利于Hp在胃黏膜的定植，然而隨著炎癥的加劇，胃黏膜上皮s LeX／A表達增加，Hp就要通過Sab A在胃黏膜定植。SLeX／A是唾液酸糖復合物，它在正常胃黏膜中含量很少，但是隨著Hp感染和其誘導的炎癥持續存在，正常狀態下胃黏膜的路易斯抗原被s LeX／A取代［9］。雖然目前國外學者對 Hp的Sab A進行了研究［10－14］，但至今人們對Sab A在Hp粘附過程中的作用及其功能尚不是十分清楚，其致病機理還有待進一步研究探討。

圖4 表達蛋白免疫印跡1：重組質粒p GEX－4T－1－sab A誘導樣品；2：重組質粒pGEX－4T－1－sab A未誘導樣品；3：空 pGEX－4T－1誘導樣品；4：E．coli BL21誘導樣品；5：Hp全菌蛋白；6：蛋白markerFig．4 Protein expression by immunoblot analysis 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；2：recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A before induction；3： plasmid p GEX －4T－1induction with IPTG；4：E．coli BL21 induction with IPTG；5：Helicobacter pylori whole cell protein；6：molecular mass marker

隨著生物技術的發展，蛋白質結晶逐漸應用于分子的生物學功能研究的這一領域，并有著重要的意義。本研究構建的重組質粒p GEX－4T－1－sab A表達蛋白中含有GST標簽，便于該融合蛋白的純化，為該蛋白質的結晶創造了有利的物質條件，并對分析該蛋白的三級結構及推測相關生物學功能奠定了基礎，從而探索出研究該蛋白功能的新途徑，這為深入研究Sab A的功能和致病機制奠定了基礎。

基因工程疫苗是防治Hp感染的一種很有前途的手段，而Hp外膜蛋白大多數位于細菌表面，具有表面暴露的特性，能引起機體的免疫反應，因此許多Hp疫苗的研究均以其外膜蛋白疫苗為抗原［15－16］。粘附是Hp感染的先決條件，也是致病的關鍵，編碼黏附素的sabA基因為Hp所特有，并在不同菌株相對保守，通過比對Hp 26695與Hp SJM180、B8、J99、P12、HPAG1、PeCan4、B38的sab A 基因的核苷酸序列和氨基酸序列，發現其核苷酸序列同源性都在87%～95%，氨基酸序列同源性在78%～94%，其中在Hp P12株變異程度最大，剔除Hp P12株信息后基因序列同源性都在91%以上，氨基酸序列同源性都在89%以上。這結果表明雖然sab A基因存在多態性，但相對于其他蛋白該外膜蛋白更保守。本研究通過Western blot進一步分析，發現該表達蛋白具有良好抗原性，提示Sab A有望成為Hp疫苗研究的候選抗原成分。

［1］Basso D，Plebani M，Kusters JG．Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］．Helicobacter，2010，15（Suppl．1）：14－20．

［2］Olfat FO，Zheng Q，Oleastro M，et al．Correlation of the Helicobacter pylori adherence factor Bab A with duodenal ulcer disease in four European countries［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2005，44：151－156．

［3］Timothy LC．Role of Helicobacter pylori Outer Membrane Proteins in Gastroduodenal Disease［J］．Journal of Infectious Disease，2006，194：1343－1345．

［4］Yamaoka Y，Ojo O，Fujimoto S，et al．Helicobacter pylori outer membrane proteins and gastroduodenal disease［J］．Gut，2006，55：775－781．

［5］Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al．顏子穎，王海林譯．精編分子生物學實驗指南［M］．北京：科學出版社，1998．

［6］Mobley HLT，Mendz GL，Hazell SL．Helicobacter pylori：Physiology and Genetics［M］．ASM Press，2001．

［7］Mahdavi J，Sonden B，Boren T，et al．Helicobacter pylori Sab A adhesin in persistent infection and chronic inflammation［J］．Science，2002，297（5581）：573－578．

［8］Nakasato F，Shimoyama T，Yoshimura T，et al．Infection of sab A－positive H．pylori does not induce anti－Lewis X antibody in host［J］．Hepato－Gastroenterology，2008，55：1122－1125．

［9］Mahdavi J，Sonden B，Hurtig M，et al．Helicobacter pylori Sab A adhesin in persistent infection and chronic inflammation［J］．Science，2002，297（5581）：573－578．

［10］Yamaoka Y．Increasing evidence of the role of Helicobacter pylori Sab A in the pathogenesis of gastroduodenal disease［J］．Infect Dev Ctries，2008，2（3）：174－181．

［11］Yanai A，Maeda S，Hikiba Y，et al．Clinical relevance of Helicobacter pylori sab A genotype in Japanese clinical isolates［J］．Gastroenterol Hepatol，2007，22（12）：2228－32．

［12］Nishioka M，Takeuchi H，Con SA，et al．The mechanical binding strengths of Helicobacter pylori Bab A and Sab A adhesins using an adhesion binding assay－ELISA，and its clinical relevance in Japan［J］．Microbiol Immunol，2010，54（8）：442－51．

［13］Sheu BS，Odenbreit S，Hung KH，et al．H．pylori Sab A enhances H．pylori density in patients lacking gastric Lewis B antigen［J］．Am J Gastroenterol，2006，101：36－44．

［14］Yamaoka Y．Increasing evidence of the role of Helicobacter pylori Sab A in the pathogenesis of gastroduodenal disease［J］．Infect Dev Ctries，2008，2（3）：174－181．

［15］劉東升，周南進，謝勇，等．幽門螺桿菌Bab A2／UreI融合基因減毒傷寒沙門菌重組活載體疫苗的構建與鑒定［J］．中華消化雜志，2009，29（9）：564．

［16］Voland P，Hafsi N，Zeitner M，et al．Antigenic Properties of HpaA and Omp18，two outer membrane proteins of Helicobacter pylori ［J］．Infection and Immunity，2003，71 （7）：3837－3843．

Cloning and expressing of Helicobacter pylori sialic acid－binding adhesion（SabA）

LI Dong－hong1，2，GONG Ya－nan2，XIAO Di2，ZHOU Nan－jin1，XIE Yong3，ZHANG jian－zhong2
（1．The Medical Institute of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2．Department of Diagnosis National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China；3．Institute of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China）

The aim was to construct a recombinant plasmid that expresses the Helicobacter pylori（H．pylori）sialic acid－binding adhesion（Sab A）for the further study of vaccine and function of Sab A．The primers were designed according to the sequence of the H．pylori 26695 sab A gene．PCR products were inserted into expression vector pGEX－4T－1，and transformed into E．coli BL21 strain for the expression．The recombinant protein was identified by MALDI－TOF－MS and the antigenicity was tested by Western blot．Results indicated that the recombinant protein was identified as H．pylori outer membrane protein Sab A by SDS－PAGE and MALDI－TOF－MS，which showed good antigenicity in Western blot．It＇s concluded that the gene sab A of H．pylori 26695 was successfully cloned and expressed in E．coli BL21，and the protein expressed has good antigenicity．

Helicobacter pylori；Sab A；gene cloning；expression

R378．2

A

1002－2694（2012）03－0197－04

＊國家科技支撐計劃（No．2007BAI04B02）資助

張建中，Email：zhangjianzhong＠icdc．cn

1．中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所診斷室，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206；2．南昌大學醫學科學研究所，南昌 330006；3．南昌大學第一附屬醫院消化研究所，南昌 330006

2011－10－27；

2012－01－05