肺癌循環腫瘤細胞的研究進展

宋英健 綜述 王正 楊林 審校

根據世界衛生組織最近公布的數據，肺癌已成為目前發病率和死亡率增長最快，對人類健康威脅最大的惡性腫瘤。在我國近幾年來隨著城市空氣污染的加重，特別是PM2.5含量持續維持高位，肺癌的發病率和死亡率明顯上升[1]。估計到2025年我國肺癌年死亡人數可達100萬，將成為肺癌第一大國。隨著個體化治療的不斷深入，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）等基因突變檢測和動態觀察成為臨床制定治療方案和預測預后的重要依據。2011年美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南明確指出，對于肺腺癌、大細胞肺癌和組織學類型不明確的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）等推薦檢測EGFR突變類型。但是由于肺癌早期發現率低，約70%-80%的患者確診時已為中晚期而無法取得肺癌組織標本，也無法接受基因和病理檢測[2]。對于早期病人組織標本獲取方法復雜，而且肺癌基因表型及分子表型可能在治療過程中發生改變，出現藥物耐藥[3]。目前肺癌組織的分子學檢測達不到實時、動態監測的目的。為了提高肺癌患者的生存率，降低死亡率，優選臨床治療方案，亟需一種手段不僅可以早期預測肺癌轉移和復發，而且可以實時和動態監測肺癌相關基因的突變類型。

1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）概述

1869年Ashworth[4]在1例因癌癥死亡的患者外周血中發現與原發腫瘤細胞體積和形態相似的細胞，從此提出了CTCs的概念。目前CTCs定義為自發或因診療操作脫離實體瘤原發灶或轉移灶進入外周血循環的一類腫瘤細胞，其極少見于正常人[5]。經過免疫逃避未被清除的CTCs不僅在一定條件下可以發展為轉移灶[6]，而且可以通過遷移、粘附、相互聚集形成循環微癌栓（circulating tumor microemboli, CTM）[7]。最新研究[8]表明這種微小癌栓還可以附著于血管內皮，導致血栓形成，引起靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism, VTE）。所以CTCs的檢測與腫瘤轉移、復發和預后評估有密切關系，而且對于晚期無法取得腫瘤組織的患者起源于實體瘤的CTCs為其靶向治療的分子學檢測開啟了一扇大門。Maheswaran等[9]利用CTCs檢測EGFR突變類型，其與原發腫瘤吻合率高達92%，而且CTCs來自于外周血，可以動態取樣，這充分說明CTCs檢測有可能作為一種基因檢測手段，用于實時動態檢測腫瘤患者的基因突變類型，指導臨床個體化治療。

2 CTCs檢測方法

2.1 CTCs富集技術 由于CTCs在外周血存在數量極少（1個CTC/106-107單個核淋巴細胞）[10]，對于檢測方法靈敏性要求很高，由于生物技術的局限性，研究者首先嘗試將CTCs進行富集，提高其濃度，從而達到檢測的目的。

密度梯度離心技術是在單個核淋巴細胞和CTCs的密度與其它血液細胞的密度不同的基礎上，依靠淋巴細胞分離液進行梯度離心富集單個核淋巴細胞和CTCs，從而達到提高CTCs濃度的目的。在此技術上建立的免疫梯度離心技術（RosetteSepTM）是建立在陰性選擇的基礎上，利用單抗混合物使非靶細胞與全血中的多個紅細胞交聯，增加非靶細胞的密度，再通過密度梯度離心，去除非靶細胞，從而增加了CTCs富集的效率[11]。2000年Vona等[12]提出ISET（isolation by size epithelial tumor cells）技術，主要是利用腫瘤細胞與正常細胞大小不同來分離CTCs。血液通過孔徑8 μm的濾膜過濾，使CTCs聚集于濾膜上，達到富集作用。Oncoquick離心法是在濾膜原理基礎上，利用一個內置多孔屏障的專用50 mL試管進行密度梯度離心，避免了全血各個層面的交叉污染，檢出率明顯高于其它方法[13]。此類富集技術簡單、方便，可以普遍使用。適合富集任何類型腫瘤的CTCs，富集的CTCs可以繼續后續免疫學和基因檢測。但由于需要血液標本量大，而且容易出現交叉污染和CTCs的丟失，限制了其進一步應用。

免疫學富集技術是目前應用最廣泛的CTCs富集方法。其利用上皮源性的惡性腫瘤均表達上皮粘附因子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratins, CK）等標記物的特點，與連有免疫磁性微球（immunomagnetic microsphere, IMMS）的特異性單抗相結合，于外加磁場的作用下吸附復合物，達到富集靶細胞的作用[14]。Tewes等[15]利用體外和體內試驗對比免疫磁珠技術與Oncoquick技術和RosetteSepTM技術，發現免疫磁珠技術回收CTCs的重復性和敏感性均高于其余兩種技術。目前通過不同磁珠和外加磁場，利用陰性或陽性選擇方式建立的免疫磁珠富集方法包括MACS系統、Dynabeads系統、EasySep系統等[16-18]。此技術優點為可以保持CTCs完整性，具有較高的重復性和敏感性。但是由于CTCs的異質性，可能導致CTCs遺漏。研究者[14]嘗試聯合其它的生物標記物富集CTCs，結果表明能明顯提高富集率，而后述的CTCs鑒定技術也大多采用聯合多種生物標記物檢測的策略。

2.2 CTCs鑒別技術 隨著生物技術的進步，越來越多的技術可以直接標記檢測、鑒定CTCs的存在和數量，根據檢測原理可分為兩大類，即細胞計數法和核酸檢測法。

2.2.1 細胞計數法 流式細胞技術（flow cytometry, FCM）是目前最常用的細胞檢測技術。其通過檢測熒光特異性抗體與腫瘤細胞特異性抗原（CK和EpCAM）結合后產生的熒光信號來鑒別CTCs。由于CK和EpCAM細胞在部分的血細胞中也有表達[19]，所以Kerbs等[20]利用CD45標記血細胞，通過陰性選擇將混雜的血細胞排除，達到提高特異性的目的。研究者利用生物標記組合，通過不同的光學檢測設備設計了不同的檢測系統，包括FAST系統、LSC系統、ACIS系統和ARIOL系統等。該方法最大的優點是定量檢測CTCs的數量，可以對CTCs多種參數（大小形態、細胞類型、存活狀態、細胞內外標記物、基因突變檢測）進行分析，但檢測靈敏性較低，需要的血液標本較多。

2.2.2 核酸檢測法 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）是目前最常用的核酸檢測方法，由于特異性的mRNA通常不在正常外周血細胞中表達，而且外周血中存在RNA酶，原發腫瘤組織分泌mRNA進入血液中都被降解。因此我們可以推測外周血中檢測到這些特異性mRNA全部來自于CTCs，間接提示CTCs的存在[21]。而定量RT-PCR（RT-qPCR）技術和多重RT-qPCR技術是在原有的基礎上通過增加內參基因，利用靶基因的組合提高CTCs檢測的特異性[22]。該方法的優點是具有高特異性、定量、快速，而且需要的血液較少。但是值得注意的是由于mRNA易降解、擴增效率和非特異性擴增的影響，會出現假性結果，該方法也破壞細胞的形態和功能，中斷了繼續分析的可能[22-24]。

2.3 富集和鑒定結合的技術 隨著對CTCs研究的不斷深入，單個技術檢測CTCs的敏感性和特異性已不能滿足研究者需求，研究者開始嘗試利用富集技術和鑒定技術相結合的方法，提高CTCs檢測的敏感性和特異性。

AdnaTest系統[25]通過免疫磁珠技術將EpCAM標記的CTCs進行富集，然后通過RT-PCR檢測腫瘤細胞特異性表達的mRNA，達到檢測CTCs的目的，該方法具有高特異性，便于發現和鑒別惡性腫瘤的特異性靶標。但是方法較為復雜，而且無法擺脫核酸檢測技術的缺陷，破壞了細胞結構，無法進行后續研究。

CellSearch系統是目前唯一通過美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準用于臨床的CTCs檢測技術，已被應用預測轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的無進展生存率（progression free survival,PFS）和總生存率（overall survival, OS），其富集方法與AdnaTest系統相似。首先利用免疫磁珠技術將EpCAM標記的CTCs從血液樣本中富集出來，然后通過特殊的生物標記或化學染色（CK8/18/19和DAPI陽性、CD45陰性）準確識別CTCs[25,26]。Βalic等[27]利用CellSearch技術和Oncoquick技術同時檢測61個腫瘤轉移患者的CTCs，發現CellSearch技術無論敏感性和回收率都高于Oncoquick技術。CellSearch技術具有高敏感性和特異性，由于形成了固定的系統，并經過FDA認證，具有自動化、高效性、高重復性的特點，而且所需血液樣本量少，易于重復檢測；缺點為仍存在漏診和誤診的情況，且檢測費用較高，使其在臨床上廣泛應用受限，而且通過系統處理的CTCs回收困難，阻礙了CTCs的后續分析[26,27]。為了進一步提高CTCs檢測效率，Hou等[28]將ISET技術和CellSearch技術結合使用，輔以核染色的方法，不僅準確檢測出CTCs，還證明了CTM的存在，但仍無法擺脫臨床應用的局限性。

2.4 其它檢測方法 2007年馬薩諸塞州總醫院開發了第一代CTC芯片（CTC-Chip），其在微流體學的CTCs檢測技術基礎上，采用微流芯片的技術，利用包被抗體的位點叢捕獲流過芯片的CTCs，達到檢測CTCs的目的。Nagrath等[29]利用CTC-Chip技術，通過EpCAM抗體篩選CTCs，篩選出的細胞再通過CK/DAPI/CD45來驗證，發現該技術具有高敏感性和特異性。但是這種芯片不僅制造相對困難、成本昂貴，且顯微位點周圍的血流通暢性限制了與抗體覆蓋位點接觸的CTCs數量。而第二代CTC-Chip芯片（microvortex-generating herringbone-chip,HΒ-Chip）通過一種小室流動槽，使樣品快速混合，增加了血液的通過量和效率；并通過安裝標準載玻片，利用標準的病理檢測方法對癌細胞進行鑒別，提高檢測的準確性，捕獲的CTCs還可用于其它檢測或培養。研究證實HΒ芯片在CTC芯片的基礎上提高了25%的癌細胞捕獲率，可捕捉血液樣本中超過90%的癌細胞，研究中從幾個患者的血液樣本中捕捉出4到12個循環腫瘤細胞群組成的CTM，其可能成為研究和檢測CTM的新方法。CTCChip技術通過模擬生物微環境篩選CTCs，保持CTCs活性，具有高敏感性和特異性，可以繼續后續的形態學和分子學的檢測，并且需要的血液標本較少，易于重復測量。由于仍局限于EpCAM篩選CTCs，可能會產生假性結果[30]。

研究者[31]還利用酶聯免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay, ELISPOT）來檢測乳腺癌和前列腺癌患者血液中CTCs的存在，通過檢測CTCs分泌的相關蛋白-上皮特異性粘蛋白和前列腺特異性抗原，判斷CTCs存在。此技術可以驗證CTCs的活性，還能檢測到腫瘤形成過程中細胞表達分泌的重要蛋白，對于CTCs與腫瘤轉移復發的相關性研究具有重要意義。但是該方法檢測靈敏度較低，而且目前無法估計CTCs的數量，應用于CTCs檢測的可行性還需要進一步研究證實。

3 肺癌CTCs臨床應用

目前普通的血液學檢測和高分辨率的影像學檢測仍然無法準確的診斷和預測肺癌患者轉移、復發和預后，也無法實時、動態選擇個體化治療方案，而與轉移和復發有密切關系的CTCs恰恰彌補了這些不足。

3.1 臨床診斷和分期 由于血液系統是腫瘤轉移的重要途徑，CTCs存在逐漸成為診斷惡性腫瘤的潛在標準。研究[32]顯示CTCs對肺癌診斷也具有潛在的應用價值。Βevilacqua等[33]利用CellSearch系統在1例肺組織穿刺活檢診斷為低分化神經內分泌瘤的患者外周血中檢測到EpCAM和CK陽性的CTCs，然而EpCAM通常在低分化神經內分泌瘤中不表達，最后在肝臟轉移灶中確診為EpCAM和CK陽性的小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）。Tanaka等[34]利用CellSearch技術比較125例肺癌患者和25例肺良性腫瘤患者的CTCs陽性率，其以1個CTC/7.5 mL作為分界點，發現肺癌患者陽性率（30.6%）明顯高于良性腫瘤患者陽性率（12.0%），說明CTCs對于肺癌診斷具有指導意義，可能成為高危患者早期篩查協助診治的重要手段。與傳統診斷手段相比，CTCs在肺癌的診斷中還處于摸索階段，還需要更多臨床證據支持，但聯合CTCs檢查后的綜合診斷會提高臨床醫師診療的警惕性。

雖然血液中檢測到腫瘤細胞并不意味著一定存在轉移灶，但研究[35]認為CTCs與腫瘤轉移有密切關系，CTCs計數越多患者面臨遠處轉移的負荷越重，未來發生轉移的病灶數也越多。Tanaka等[34]利用受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve, ROC曲線）證明了肺癌患者外周血中CTCs的含量跟肺癌進展特別是肺癌轉移具有相關性。Hou等[36]的研究同樣表明，CTCs的存在與腫瘤分期存在明顯的相關性，CTCs計數隨著疾病分期的增加而明顯增加，廣泛期患者計數明顯高于局限期；而且發現SCLC患者外周血中CTCs計數明顯高于其它類型的肺癌，這也驗證了臨床上SCLC患者更容易發生全身轉移。Yie等[37]應用RT-PCR對143例NSCLC患者進行檢測，發現表達Survivn mRNA的CTCs與腫瘤侵犯程度和淋巴結轉移狀態有關。目前CTCs可作為肺癌組織學類型及臨床分期的有益補充，其存在可被視為腫瘤TNM分期的中M分期的真實狀態。結合病理學和影像學的檢查結果，可以更準確的反映患者當前病情。

3.2 預后判斷和療效評價 肺癌患者的預后和抗腫瘤藥物的療效與多種因素有關，目前眾多的研究提示CTCs可早期判斷預后，評價抗腫瘤藥物療效。一項小規模的臨床研究[38]中利用CellSearch技術，以2個CTCs/7.5 mL作為分界點，發現復發肺癌患者比新發肺癌患者CTCs陽性率高（83% vs 78%），說明了CTCs與肺癌復發有密切關系。而且在其中12例患者的隨訪中同種方案一線化療2個療程后影像學變化與CTCs變化具有相關性，影像學中腫瘤好轉伴隨著CTCs計數的減少。雖然為小樣本的臨床實驗，但是可以看到CTCs在肺癌的預后評估和療效評價方面的重要性。

在NSCLC領域Hofman等[39,40]認為利用ISET技術從手術后NSCLC患者外周血中分離出的細胞為非血細胞的循環細胞（circulating non-haematological cells, CNHCs），通過對比發現上述患者10 mL外周血中含有50個CNHCs以上患者的OS和PFS明顯低于另一組，并且在I期+II期患者中具有較高的復發和死亡的風險。而CNHCs中CTCs的存在可能是導致陽性結果的重要原因。2011年Krebs等[20]利用CellSearch技術檢測101例III期-IV期NSCLC患者CTCs數量，未化療前以5個CTCs/7.5 mL為分界點，發現其OS存在統計學差異（＞5：4.3個月；＜5：8.1個月）；同種方案化療1周期后以2個CTCs/7.5 mL為分界點，多因素分析發現CTCs數量跟化療后療效和OS有關，說明CTCs檢測在預測NSCLC患者化療療效和預后方面具有重要作用。

在SCLC中研究者利用CellSearch技術發現在50例患者中80%的患者CTCs陽性，其中在7.5 mL血液中CTCs含量＞300的患者中位生存期（134天）明顯低于CTCs含量＜2的患者中位生存期（443天），而且經過1個療程一線化療后大多數患者出現CTCs含量下降，在22天時陽性率只有60%，說明CTCs可以反映SCLC變化和評估化療方案療效[36]。Hou等[28]在小樣本研究（97例SCLC患者）中發現未治療前CTCs數量和化療后CTCs變化量可以預測患者OS。而且他們認為ISET技術和CellSearch技術篩選出的CTCs中還存在CTM和已凋亡的CTCs，他們通核染色方式將篩選出的CTCs分為單個有活性CTCs、CTM和凋亡CTCs三組，而在CTM中并未發現凋亡CTCs，這可能預示著CTM存在特殊的保護機制防止CTCs凋亡和化療藥物的殺傷，其可能成為肺癌治療的新靶點。

在乳腺癌領域2012年即將公布初步結果的SWOG S0500試驗中，隨機選取500例（≥5CTCs）乳腺癌轉移女性患者，研究其在化療3周后CTCs持續高表達（≥5CTCs）換用其他化療方案患者是否受益。其研究的主要終點為PFS和OS。利用這項實驗結果將可以明確CTCs臨床檢測和治療方案更換的意義，而這也可以預測在肺癌領域CTCs對于治療方案變更的價值。

目前CTCs對于肺癌預后和療效判斷的研究樣本量較少，而且肺癌CTCs的檢測方法和使用的腫瘤標記物也不同，所以關于CTCs與肺癌預后關系的研究尚需通過大規模、多中心的隨訪研究進行驗證。

3.3 個體化治療應用 近年來基因診斷指導腫瘤個體化治療的研究越來越受重視，由于晚期或非手術腫瘤患者組織標本獲取困難，使基因檢測在一定程度上受到限制，而且研究[41]發現由于腫瘤的異質性，腫瘤的演變過程中存在進化，原發部位和轉移灶可能存在基因型的改變。因此，在腫瘤個體化治療過程中實施動態監測原發灶和轉移灶中腫瘤細胞及其基因變化成為亟需解決的問題。CTCs作為兩者之間的橋梁，能同時反映原發灶和轉移灶的性質，在個體化治療中起重要作用。

EGFR的突變可以預測肺癌對于TKI靶向藥物的療效，在肺癌的個體化治療中起著重要作用[42]。由于CTCs檢測技術的局限，研究者首先想到利用血液循環中游離的腫瘤循環DNA進行檢測肺癌EGFR突變。Kimura等[43]使用擴增阻滯突變系統（amplified refractory mutation system,ARMS）的方法檢測了NSCLC患者的腫瘤組織和血清的EGFR突變信息并進行對比，結果發現具有較高的一致率（72.7%），這可能由于血清中游離DNA主要來自CTCs的凋亡所造成的。隨著CTCs檢測技術的不斷進步，研究者開始利用CTCs自身來進行EGFR突變檢測。Maheswaran等[9]利用CTC-Chip技術將NSCLC患者血液中的CTCs收集并提取DNA，再利用ARMS法檢測其EGFR突變類型，其與原發腫瘤突變吻合率高達92%，明顯高于血漿游離DNA突變吻合率。而且在肺癌患者CTCs的基因檢測中發現20號外顯子T790M位點突變與TKI藥物耐藥有明顯關系，并且明顯降低了患者PFS。這充分說明CTCs的檢測可以在個體化治療的過程中動態的監測腫瘤細胞及其EGFR基因變化。

隨著靶向基因的不斷涌現，肺癌CTCs也可用于其他生物標記物的檢測，優化個體化治療方案。最近的研究[44]中，研究者利用FAST系統檢測晚期NSCLC患者CTCs中核苷酸切除修復交叉互補組1（excision repair cross complement group 1, ERCC1）的表達，發現ERCC1在NSCLC患者CTCs表達水平與鉑類藥物化療療效和生存期呈負相關，提示CTCs可用于預測鉑類化療的療效和患者生存期。研究者[36]還應用CellSearch系統檢測了SCLC患者外周血中的CTCs，并分析了死亡細胞血清標記物。結果提示在局限期及廣泛期SCLC患者外周血均可檢出CTCs，并通過檢測CTCs中CD56證實其為腫瘤來源，提示CTCs及細胞死亡血清學標記物有可能成為促進藥物開發的藥效學標記。

CTCs對肺癌個體化治療具有潛在重大意義，可以實時、動態的檢測肺癌患者的分子學類型，反映腫瘤的生物學狀態，為患者個體化治療提供理論基礎和臨床證據。但能否完全代替原發組織標本指導分子靶向治療，尚需大規模的前瞻性研究來證實。

4 困惑與障礙

自從CTCs發現以來人們不斷研究其在腫瘤轉移和復發中的作用，Fidler等[45]采用放射性碘標記腫瘤細胞注入動物體內，24 h后只有0.1%的腫瘤細胞保持存活，而形成轉移的腫瘤細胞不到0.01%。為了解釋腫瘤轉移效率低這一現象，近年逐漸形成上皮- 間充質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT）理論。EMT最初定義為在胚胎時期上皮細胞喪失其上皮特性而獲得間充質細胞特性的過程，其在胚胎干細胞分化過程中起著關鍵作用[46]。研究發現在腫瘤患者中隨著腫瘤細胞不斷增殖，部分細胞也會出現EMT，導致上皮表型標志E-鈣粘素表達下降，而波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1等間充質表型特征分子上調，致使細胞失去極性，粘附能力下降，運動能力增強，造成腫瘤細胞脫落于局部，一部分由于參與細胞結構組成的上皮細胞結構蛋白的缺失，致使細胞結構松弛變形，然后侵入結締組織間隙并穿過基底膜進入血液循環系統，另一部分細胞由于腫瘤擴張生長，毛細血管破裂，直接進入血液系統，形成CTCs[47]。這就說明了腫瘤CTCs可能存在異質性，需要更多的生物標記物來檢測。而極少數逃過免疫反應和凋亡的CTCs通過間充質-上皮轉化（mesenchymal-epithelial transition, MET）重新獲得上皮表型或者通過形成CTM在毛細血管末端形成癌栓，突破血管屏障，從而形成轉移灶。De Wever等[48]研究發現CTCs檢測困難可能是由于EMT過程中形成間質性CTCs，其在腫瘤轉移過程中起著重要作用。Iwatsuki等[49]利用腫瘤患者外周血中CTCs找出于5個與EMT相關的基因。這不僅可以作為一種新型檢測CTCs的基因靶點，而且也進一步驗證了EMT在CTCs形成過程中的重要性。除此之外腫瘤干細胞等理論的存在，都表明僅僅依靠上皮細胞特異的生物標記物或者單一的生物標記物并不能代表腫瘤CTCs的全部特征。還需要更多關于腫瘤復發、轉移的分子和遺傳機制的深入研究，以達到提高檢測技術的特異性和敏感性的目的，使其應用于臨床。

5 展望

綜上所述外周血CTCs檢測在肺癌轉移的早期診斷和預后預測方面具有重要意義，其可以指導分子靶向藥物的應用、評估治療療效。雖然外周血CTCs檢測方法進步迅速，但仍有以下問題值得注意：①具有高特異性和敏感性的技術仍是應用于臨床檢測的關鍵，臨床檢測CTCs的技術仍要改善；②更多、更特異的生物標記物，特別是基于EMT、腫瘤干細胞和CTM等CTCs理論相關的生物標記物的發現，有助于提高肺癌CTCs檢測的準確性和重復性；③進一步深化肺癌復發和轉移的分子和遺傳機制研究，將有助于提高CTCs檢測的預測性和指導性，并有可能成為新抗肺癌藥物開發和篩選的基礎；④在兼顧準確性的同時也要選擇盡量簡單、易行、花費小的方法，將有助于CTCs盡快的進入臨床。CTCs的檢測和研究將有助于提高肺癌患者的生活質量和生存時間，必將成為臨床肺癌診治的必要手段。