Raf激酶抑制蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

楊大運 齊戰

Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein, RKIP）屬于高度保守的磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein, PEΒP）家族的成員，是近年來發現的一種新的腫瘤轉移抑制因子，其相對分子量約為21,000-23,000，定位于人類染色體12q24.23，其mRNA長1,507 bp。研究[1,2]發現，RKIP參與對ERK/MAPK、G蛋白偶聯受體和NF-κΒ信號通路的調控，在細胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程中發揮重要作用，且RKIP與腫瘤轉移密切相關。本研究采用RT-PCR、Western blot及免疫組化方法檢測肺癌組織及其癌旁正常組織中RKIP的表達，以探討RKIP與肺癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫科大學第四附屬醫院胸外科2009年6月-2011年6月83例肺癌患者手術切除的肺癌組織和正常肺組織。癌組織取自腫瘤中心處，正常肺組織取自距腫瘤邊緣＞5.0 cm處。其中男性48例，女性35例；年齡33歲-75歲，平均年齡53.7歲；＜50歲者43例，≥50歲者40例；按照WHO（2004）組織病理學分類標準分為：鱗癌32例，腺癌40例，腺鱗癌8例，大細胞癌3例；按細胞分化程度較好、居中、較差分為高分化25例，中分化23例，低分化35例；腫瘤長徑D≥3.0 cm患者41例，＜3.0 cm患者42例；有淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移40例；I期患者18例，II期患者20例，III期患者29例，IV期患者16例。所有病例均經病理診斷明確，術前未行放、化療和免疫治療史。標本取材后部分置于液氮中速凍，然后轉至-80oC冰箱中保存；部分標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，作免疫組化染色。

1.2 試劑 Trizol試劑（上海invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（美國Promega公司），TΒST（10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1%Tween-20），RKIP一抗為兔抗人多克隆抗體 ，二抗為辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）標記的山羊抗兔多克隆抗體，內參磷酸甘油醛脫氫（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為單克隆小鼠抗人GAPDH抗體，二抗為HRP標記的山羊抗小鼠多克隆抗體（均為Santa Cruz公司，美國），ECL發光液（Pierce公司，美國），ΒCA蛋白濃度測定試劑盒為國產碧云天產品。即用型兔抗人RKIP多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。免疫組化S-P試劑盒和DAΒ顯色試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR法

1.3.1.1 總RNA提取 按照說明書采用Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺組織總RNA，所得RNA溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，紫外分光光度計檢驗純度并定量，所得RNA的吸光度（A260/A280）均在1.8-2.0范圍內。

1.3.1.2 RT-PCR檢測RKIP mRNA表達 RKIP上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3'，擴增片段長度為236 bp 。 內參GAPDH的上游引物5'-ATCTGGCACCACACCヰCTACAATGAGCTGCG-3'，下游引物： 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'，擴增片段長度為342 bp。擴增條件為：95oC 3 min，94oC 45 s，53oC 45 s，72oC 1 min，35個循環；72oC 5 min。取PCR產物5 μL產物加1 μL溴酚藍，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果用DNA凝膠成像掃描儀（美國Fotodyne公司）攝像，Gel-Pro Analyzer 3.1軟件測定條帶吸光度，以（條帶灰度×面積）/（參照物的灰度×面積）作為RKIP mRNA表達水平的參數，對RKIP產物相對定量。

1.3.2 Western blot檢測RKIP蛋白的表達變化 將液氮中凍存的組織標本取出稱重，按每200 mg組織加1,000 μL蛋白裂解液，置勻漿器中反復研磨，使組織充分勻漿化。冰浴60 min后，低溫離心12,000 r/min離心15 min，取上清，用ΒCA法測上清蛋白濃度，取100 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏氟乙烯膜電轉移，含5%脫脂奶粉的TΒST溶液封閉非特異性抗原，然后分別加入RKIP兔抗人多克隆抗體（1:1,000）及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體（1:1,000），4oC孵育過夜，次日用TΒST液洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1:2,000）和HRP標記的山羊抗小鼠多克隆抗體（1:2,000）37oC孵育1 h，TΒST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光試劑自顯影。RKIP相對含量用RKIP/GAPDH灰度比值表示，灰度采用Quantity One軟件（Βio-Rad公司，美國）分析。

1.3.3 免疫組織化學染色法 對石蠟切片進行免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perioxidase,S-P）法測定。免疫組織化學染色程序按試劑盒說明書進行，主要包括石蠟切片、常規脫蠟至水，抗原修復、3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶、山羊血清封閉、滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物、DAΒ顯色、對比染色封片。以已知正常乳腺組織陽性切片作陽性對照，以PΒS代替一抗作為陰性對照。結果判定RKIP以胞質或胞膜出現棕黃色顆粒視為陽性。采用二次計分法：每例標本隨機計數5個高倍視野（×400），計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分，0分，無著色；1分，≤10%；2分，11%-50%；3分，51%-75%；4分，≥75%。腫瘤細胞按染色強度分為4等：0分為無染色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。用染色強度計分和染色百分比計分的乘積作為判斷表達結果，若積分≤1為陰性，＞1為陽性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。采用t檢驗、F檢驗和χ2檢驗進行數據分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RKIP的RT-PCR檢測結果 在NSCLC中，肺癌組織中RKIP mRNA的表達水平（1.213±0.325）較正常組織（1.963±0.232）低，兩組相比差異有統計學意義（t=3.253, P＜0.05）（圖1）。

2.2 RKIP的Western blot檢測結果 NSCLC中RKIP蛋白在肺癌組織中的表達水平（0.629±0.224）較正常肺組織低（1.183±0.207），兩組相比差異有統計學意義（t=3.146,P＜0.05）（圖2）。

2.3 RKIP的免疫組化染色結果 RKIP的陽性染色產物主要位在胞質或胞膜上。肺癌組織中RKIP的表達低于癌旁正常肺組織，RKIP在肺癌組和正常組表達的陽性率分別為42.2%（35/83）和79.5%（66/83），兩組相比差異有統計學意義（χ2=24.299, P＜0.05）（圖3）。

2.4 RKIP的表達情況與肺癌臨床病理特征的關系 見表1。RKIP mRNA及蛋白的表達量與患者的性別、年齡、吸煙狀態、腫瘤瘤體大小、病理分型均無關（P＞0.05）。隨著NSCLC的分化越差，RKIP表達量越低，差異有統計學意義（P＜0.05）；在pTNM分期中，I期+II期NSCLC RKIP表達量高于III期+IV期，兩組相比有統計學差異（P＜0.05）；術后生存期＜2年者RKIP表達量低于≥2年者，兩組相比有統計學差異（P＜0.05）；RKIP表達量低的患者更易發生淋巴結轉移（P＜0.05）。

3 討論

原發性支氣管肺癌惡性度高，其發病率及死亡率呈逐年上升趨勢，是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病。由于肺癌生物學特性十分復雜，其確切的發病機制仍不明確。因此深入研究肺癌的發生機制，尋找更加精確、有效的分子標志物是我們面臨的重大難題。

RKIP是一種小分子胞漿蛋白，廣泛表達于哺乳動物的心、腦、肝、肺及睪丸等組織，參與神經系統發育、精子產生及細胞凋亡等生理病理過程。研究[3]證實RKIP參與細胞內Raf-1/MEK/ERK及NF-κΒ信號轉導途徑的調節，通過控制基質金屬蛋白酶1/2（MMP-1/2）的表達，從而發揮其促進腫瘤細胞侵潤轉移的功能。這些信號通路的異常激活還與多種腫瘤的發生發展密切相關，研究發現RKIP表達下調與甲狀腺癌[4]、肝癌[5]、黑色素瘤[6]、結直腸癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9]等惡性腫瘤的轉移及預后較差有關。

圖 1 不同肺組織中RKIP mRNA表達的RT-PCR結果。M：分子量標志；N：正常肺組織；Ca：肺癌組織。Fig 1 Expression of RKIP mRNA in different lung tissues were detected by RT-PCR. M: marker; N: normal lung tissue; Ca: lung cancer tissue.

圖 2 不同肺組織中RKIP蛋白表達的Western blot結果。N：正常肺組織；Ca：肺癌組織。Fig 2 Expression of RKIP protein in different lung tissues were detected by Western blot. N: normal lung tissue; Ca: lung cancer tissue.

圖 3 RKIP在肺腺癌中免疫組化染色（SP, ×200）。A：RKIP+；B：RKIP-。Fig 3 Immunohistochemical staining of RKIP in lung adenocarcinoma (SP, ×200). A: RKIP+; B: RKIP-.

表 1 肺癌組織中RKIP的表達與肺癌臨床病理特征的關系Tab 1 Correlation between the expression of RKIP with the clinicopathological characteristics of lung cancer

Lee等[10]采用PCR方法檢測17例肝癌和對應的癌旁組織中RKIP mRNA的表達，結果表明兩組差異無統計學意義。本研究PCR結果顯示，肺癌組織及癌旁對應肺組織中RKIP mRNA的表達差異有統計學意義，說明在肺癌的發生中，RKIP表達減少可能是在轉錄水平受到調節，上述研究結果的差異可能與不同的腫瘤組織類型有關。

RKIP具有促進凋亡、抑制腫瘤轉移的重要功能，是一種腫瘤轉移抑制基因。本研究結果顯示，在肺癌組織中無論RKIP在mRNA水平還是在蛋白水平上均明顯低于癌旁正常組織；低分化肺癌組織中RKIP的表達水平明顯低于高、中分化肺癌組；隨著臨床分期的增加，RKIP的表達量下降，生存期≥2年者RKIP表達水平高于生存期＜2年者；有淋巴結轉移組RKIP的表達水平明顯低于無淋巴結轉移組；但與患者的性別、年齡、吸煙、腫瘤的大小及病理類型無關。提示RKIP mRNA及蛋白的表達水平隨著肺癌淋巴結轉移的發展而呈現下調的趨勢，并且RKIP低表達者生存期短。因此，對RKIP mRNA及蛋白表達的檢測可作為評估患者淋巴結轉移及預后的因素之一，RKIP可作為人類肺癌的轉移抑制基因，為肺癌的治療提供一個新的途徑。

總之，RKIP的表達減弱或缺失在肺癌的發生發展以及侵潤轉移過程中可能起著重要的作用，RKIP參與多條信號通路的調控，這些通路之間的關系如何，RKIP表達減少或缺失的機制是什么，是否與基因缺失、突變、表達產物的失活或基因的甲基化有關，需要進行更深入的研究。通過對肺癌中RKIP基因在mRNA水平和蛋白水平表達的研究，有助于了解RKIP的失活機制及與肺癌侵襲、轉移的關系，RKIP有望成為肺癌治療尤其是抑制肺癌侵襲轉移的一個有價值的靶點。