Snail和Claudin-3在非小細胞肺癌中的表達及意義

李娟 涂媛 蔣莉莉 徐緩 張尚福

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年有超過一百萬人死于肺癌，占癌癥總死亡人數的26%-29%[1]。其中，80%的患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。由于早期癥狀不典型，多數患者就診時已處于晚期，導致其預后差，5年生存期約為15.6%[2]。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition, EMT）被認為是腫瘤浸潤和轉移的關鍵步驟，鋅指轉錄因子Snail是調控EMT的重要轉錄因子。它主要通過與上皮鈣粘素（E-cadherin）啟動子區的E-box連接基序結合，抑制E-cadherin轉錄表達，同時直接抑制緊密連接蛋白（Claudin）的表達，誘導EMT發生。近年來對腫瘤侵襲轉移機制研究發現Snail能提高多種腫瘤的侵襲能力。Claudin是構成緊密連接（tight junction, TJ）的骨架蛋白，有24個異構體，具有參與維持細胞的屏障功能，決定細胞旁物質選擇滲透性和細胞極化等重要生理功能，其表達數量和分布結構的變化直接影響TJ的結構和功能[3,4]。Claudin-3是其家族成員。人類Claudin-3定位于7q11.23。人體內乳腺導管上皮細胞、卵巢上皮細胞、子宮內膜、食管黏膜、胰腺腺泡細胞及導管和胰島細胞、前列腺上皮細胞、支氣管和肺泡上皮細胞中均有Claudin-3的表達。近期研究發現Claudin-3在某些腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和食管腺癌的mRNA和蛋白表達均明顯增高[5-10]，而在大腸癌中表達下調，其具體機制尚不完全清楚[11]。

本實驗利用組織芯片技術和免疫組織化學染色檢測Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC組織及其淋巴結轉移灶中的表達情況，探討兩者在NSCLC中表達的意義，為其應用于NSCLC的診斷和預后判斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集四川大學華西醫院1998年1月-2003年12月手術切除的NSCLC病例，從中選出臨床資料完整和石蠟組織保存完好的病例共302例，組織學類型包括鱗狀細胞癌（以下簡稱鱗癌）、腺癌、腺鱗癌和大細胞癌。其中伴有轉移灶146例，實際收集其淋巴結轉移性癌組織57例。另取同期手術的59例癌旁正常肺組織作為對照。患者截至術前均未行放療或化療。所有標本均由病理學教授帶領復習HE染色切片，明確病理診斷。302例NSCLC標本均經切片、HE染色，明確病理診斷（2003年WHO肺腫瘤組織學分類標準）。其中，男性243例，女性59例，男：女為4.12:1。發病年齡35歲-82歲，中位年齡61歲。鱗癌138例，腺癌124例，腺鱗癌33例，大細胞癌7例。其中高分化癌（包括高分化鱗癌、高分化腺癌）20例；中分化癌（包括中分化鱗癌、中分化腺癌）131例；低分化癌（包括低分化鱗癌、低分化腺癌、腺鱗癌、大細胞癌）151例。TNM分期，I期98例（Ia期10例，Ib期88例），II期71例（IIa期25例，IIb期46例），III期112例（IIIa期92例，IIIb期20例），IV期21例（2009年肺癌國際分期修訂版）。生存時間0.06個月-96個月，中位生存時間35.3個月。I期患者的5年生存率為37.8%，II期為32.9%，III期為8.0%，IV期患者基本都在2年內死亡。生存期的計算從手術日期起到隨訪日期或由于復發、轉移而死亡的日期為止。

1.2 組織芯片的制作 采用手工制作組織芯片。首先根據HE染色切片觀察，確定代表性病變部位后在組織切片和相應石蠟組織塊上標志，并在空白石蠟塊上鉆孔，組織片直徑與孔徑一致（內徑為1.5 mm），再用金屬空心管從經定位的目標石蠟塊上鉆取組織并轉移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應位置。連續切片后，將切下的5 μm厚組織裱于經防脫片處理的載玻片上，置于56oC烤箱中烘烤72 h。常溫保存備用。

1.3 免疫組織化學染色 兔抗人Snail多克隆抗體和兔抗人Claudin-3多克隆抗體分別購自北京博奧森生物技術有限公司和福州邁新生物技術開發有限公司。免疫組化試劑盒和DAΒ顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。Snail一抗的工作稀釋濃度為1:50，實驗采用MaxVision法；Claudin-3為工作液，實驗采用EnVision法進行免疫組化染色，具體步驟嚴格按照產品說明書進行。分別用已知陽性的胃腺癌組織和結腸腺癌組織作為Snail和Claudin-3的陽性對照，以0.01 mol/L PΒS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學結果判定 Snail和Claudin-3以細胞核或/和細胞漿出現棕黃色為陽性細胞。每張切片高倍鏡下隨機選取10個視野共記錄1,000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。①按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：0分為＜5%；1分為5%-＜25%；2分為25%-＜50%；3分為50%-＜75%；4分為≥75%。取①、②兩項評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1分-4分為弱陽性（+）；5分-8分為中等強度陽性（++）；≥9分為強陽性（+++）[12]。

所有染色結果的判定和計數均采用統一的評分標準，在對樣本臨床資料完全不知的情況下，由兩名研究者分別對實驗結果進行判斷、評分。若兩人評定結果相差3分則重新評定。

1.5 統計分析 等級資料采用秩和檢驗，采用Spearman等級相關分析，應用Kaplan-Meier法（組間生存率比較采用Log-rank檢驗）和Cox比例風險回歸模型進行生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發灶和淋巴結轉移灶中的表達 Snail和Claudin-3陽性信號定位于細胞質或/和細胞核。兩種蛋白陽性表達均見于支氣管上皮和II型肺泡上皮細胞。在間質組織中也可見Snail和Claudin-3的陽性信號（圖1）。在NSCLC原發灶和淋巴結轉移灶中表達強度不同（圖2，圖3) 。

Snail在癌旁正常肺組織、NSCLC原發灶以及淋巴結轉移灶中的表達逐漸增強，陽性率分別為47.5%（28/59）、92.1%（278/302）及96.5%（55/57），差異具有統計學意義（χ2=89.097, P＜0.05)。兩兩比較發現，Snail在NSCLC原發癌組織中的陽性表達率高于癌旁正常肺組織（P＜0.05）、低于淋巴結轉移癌組織（P＞0.05）。Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發灶以及淋巴結轉移灶中的表達逐漸減弱，陽性率分別為88.1%（52/59）、60.3%（182/302）及45.6%（26/57），差異具有統計學意義（χ2=18.667, P＜0.05）。兩兩比較發現，Claudin-3在NSCLC原發癌組織中的陽性表達率分別低于癌旁正常肺組織（P＜0.05）、高于淋巴結轉移癌組織（P＞0.05）（表1）。

圖 1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織中的表達（A: Snail, MaxVision; B: Claudin-3, EnVision;×400）Fig 1 Expression of Snail and Claudin-3 in normal lung tissues (A: Snail, MaxVision; B:Claudin-3, EnVision; ×400)

圖 2 Snail在NSCLC原發灶及淋巴結轉移灶中的表達（MaxVision, ×400）Fig 2 Expression of Snail in NSCLC primary foci and lymph node metastases (MaxVision,×400). A: Squamous cell carcinoma; B:Lymph node metastases of squamous cell carcinoma; C: Adenocarcinoma; D: Lymph node metastases of adenocarcinoma. NSCLC:non-small cell lung cancer.

2.2 Snail和Claudin-3在NSCLC原發灶中的表達與臨床病理特征之間的關系 NSCLC原發灶中，Snail和Claudin-3的表達均與腫瘤組織學類型（χ2=9.443, P=0.024; χ2=23.863,P＜0.05）有關。而與患者的年齡、性別以及腫瘤大小、病理分級、有無癌轉移和TNM分期無關（表2）。

2.3 Snail和Claudin-3在NSCLC組織中表達的相關性Spearman等級相關分析顯示，Snail和Claudin-3在NSCLC組織中的表達呈負相關（r=-0.178, P=0.002）。

2.4 Snail和Claudin-3表達與預后的關系

2.4.1 Kaplan-Meier單因素生存分析 將Snail和Claudin-3表達分為表達（+-+++）和不表達（-）兩組。Snail表達組和不表達組5年生存率分別為8.3%和0.7%；Claudin-3表達組和不表達組5年生存率分別為6.0%和3.0%。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者生存曲線，Log-rank檢驗不同樣本的生存曲線，結果顯示（圖4，圖5）：Snail不同表達之NSCLC患者的生存率差異無統計學意義（χ2=1.539,P=0.215）。Claudin-3不同表達之NSCLC患者的生存率差異無統計學意義（χ2=2.942, P=0.086）。

圖 3 Claudin-3在NSCLC原發灶及淋巴結轉移灶中的表達（EnVision, ×400）Fig 3 Expression of Claudin-3 in NSCLC primary foci and lymph node metastases(EnVision, ×400).A: Squamous cell carcinoma; B: Lymph node metastases of squamous cell carcinoma;C: Adenocarcinoma; D: Lymph node metastases of adenocarcinoma.

圖 4 Snail表達組和Snail不表達組NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig 4 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with or not expression of Snail

圖 5 Claudin-3表達組和Claudin-3不表達組NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig 5 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with or not expression of Claudin-3

2.4.2 Cox比例風險回歸模型分析 對患者的年齡、性別、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、Snail和Claudin-3的表達等可能與預后有關的指標進行分析。采用前向逐步法，顯示在α=0.05的水平上，腫瘤大小、組織學類型、病理分級、有無癌轉移、TNM分期這5個因素被篩入Cox模型內（表3），是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。其中，腫瘤大小、組織學類型、有無癌轉移和TNM分期的偏回歸系數為正值，表明腫瘤越大、分化程度越低和伴有癌轉移，患者死亡的風險越大。病理分級的偏回歸系數為負值，說明分化愈低，患者死亡風險愈高。由相對危險度得知：NSCLC的腫瘤直徑＞3 cm的患者其死亡風險是直徑≤3 cm患者的1.68倍；伴有癌轉移的患者其死亡風險較不伴有癌轉移患者增加了58.5%；隨著腫瘤分級由高到低的變化，患者的死亡風險依次增加31.6%。隨著TNM分期的遞增，患者的死亡風險依次增加52.5%。NSCLC患者的性別（P=0.639）、年齡（P=0.783）、Snail的表達（P=0.561）、Claudin-3的表達（P=0.265）和Snail與Claudin-3的差異性表達（P=0.265）對患者預后的影響無統計學意義。

表 1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發灶及淋巴結轉移灶中的表達Tab 1 Expression of Snail and Claudin-3 in normal lung tissues, NSCLC primary foci and lymph node metastases

表 2 Snail和Claudin-3的表達與NSCLC臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between expression of Snail and Claudin-3 and pathological charaeteristics of NSCLC

表 3 Cox回歸模型篩選的影響NSCLC患者的危險因素Tab 3 The risk fact of NSCLC patients selected by Cox regression model

3 討論

EMT是指細胞由上皮表型向間質表型轉化的過程，具有轉分化特征，即上皮細胞極性喪失及其間質特性獲得。上皮細胞極性喪失表現為上皮標記如E-cadherin、Claudin、Occludins和Muc1的丟失，是EMT的重要特征之一。E-cadherin是上皮細胞表面的粘附分子，對于細胞之間的粘附起到重要的作用。Claudin是構成TJ的骨架蛋白，對維持細胞完整性起著至關重要的作用[5]。E-cadherin和Claudin表達下調常使細胞之間的粘附能力下降、凝聚力降低、分化變差、轉移和侵襲能力增強。此外，Claudin-3不僅具有調節細胞間物質流動和維持上皮細胞極性的功能，還參與細胞增殖分化、基因轉錄、腫瘤抑制等過程。故在腫瘤發生、發展及轉移過程中發揮重要作用。

研究發現，Claudin在不同的腫瘤組織中發揮不同的作用，表達也不相同。Claudin-3在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌中表達上調[6-9]，而在大腸癌及NSCLC中表達下調[10,11]。

本實驗結果顯示，在59例癌旁正常肺組織中，Claudin-3的陽性表達見于支氣管上皮和II型肺泡上皮細胞。在302例NSCLC原發癌組織中，Claudin-3的陽性表達率為60.3%，Claudin-3在NSCLC組織中的陽性表達率低于癌旁正常肺組織，其表達與腫瘤的組織學類型有關，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、有無轉移以及TNM分期無關。Claudin-3在不同組織學類型NSCLC中的表達各不相同，具體陽性表達率如下：在鱗癌中為50%；在腺癌中為69.3%；在腺鱗癌中為87.9%；在大細胞癌中為28.6%。其表達率由高到低分別為腺鱗癌、腺癌、鱗癌和大細胞癌。其他學者的研究也證實Claudin-3在不同組織學類型肺癌中的表達存在差異，這種差異有助于肺癌組織學類型的區分[12]。有研究[13]發現Claudin-3的表達與前列腺癌的臨床病理分期及復發密切相關，在III期、IV期腫瘤組織中的表達高于I期、II期，在復發腫瘤中的表達高于無復發腫瘤。本實驗中，Claudin-3在NSCLC原發癌組織中I期、II期患者中表達率低于在III期、IV期患者中的表達率，其差異無統計學意義。

EMT的另外一個重要方面是間質特性的獲得，即間質標記如成纖維細胞樣的外形、波形纖維蛋白、Snail、骨橋蛋白基因的表達。Snail是鋅指轉錄因子超家族成員，其主要功能是調控EMT。E-cadherin被認為是Snail直接作用的靶基因。Snail主要以鋅指區域與E-cadherin啟動子上的E-box序列結合，達到抑制E-cadherin轉錄的作用。腫瘤發生EMT時，E-cadherin的表達降低或缺失、細胞間的粘附力減弱、細胞之間彼此分離、獲得活動能力并抵抗凋亡，腫瘤細胞易于從原發灶上脫落。而腫瘤細胞從原發部位脫落是腫瘤浸潤和轉移的第一步，也是EMT發生的標志。Snail通過抑制E-cadherin、Claudin-3等的表達來促進EMT的發生，在腫瘤的浸潤轉移中起重要作用。

研究發現，Snail在乳腺癌、食管鱗癌、肺癌等多種腫瘤中表達上調[14-19]，并與腫瘤的組織學類型、病理分級、侵襲轉移、生存時間等有關。

本研究顯示，59例癌旁肺組織中，Snail在支氣管上皮和II型肺泡上皮細胞呈陽性表達；在302例NSCLC中，Snail陽性表達率為92.1%。Snail在NSCLC中的表達高于正常肺組織，與文獻報道一致[18]。Snail在302例NSCLC原發癌組織中的表達與患者的組織學類型有關，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、有無轉移以及TNM分期無關。Snail不同組織學類型NSCLC中表達不同，具體陽性表達率如下：在鱗癌中為87%；在腺癌中為96.8%；在腺鱗癌中為94%；在大細胞癌中為100%。其表達率由高到低分別為大細胞癌、腺癌、腺鱗癌和鱗癌。本實驗結果提示，在NSCLC中，Snail可能具有促進腫瘤細胞的轉移和腫瘤演進的作用，尚有待進一步深入研究證實。

本研究顯示，Snail和Claudin-3在NSCLC組織中的表達呈負相關，提示兩種蛋白在腫瘤的發生、發展中起不同的作用。

目前，有學者在研究肺癌靶向治療時將目光瞄準了Snail和Claudin-3。如通過siRNA靶向干擾Snail的表達可增加順鉑誘導的A546肺癌細胞的凋亡，聯合化療藥物和靶向抑制Snail因子大大提高了肺癌治療的有效性[20]；或者通過siRNA沉默Snail基因的表達或通過反義Snail阻止EMT和腫瘤的轉移，利用化療藥物抑制Snail蛋白的生成，可望能有效地抑制腫瘤的侵襲和轉移，從而大大提高抗腫瘤效力。而圍繞Claudin-3靶向治療的研究主要在于兩個方面：抗Claudin抗體的制備和利用肉毒素產氣莢膜桿菌（clostridiumperfringens enterotoxin, CPE）定位Claudin。前者基于利用抗Claudin抗體對抗Claudin的細胞外域。后者利用CPE與Claudin-3的結合，CPE是分子量為35 kDa的單鏈多肽，其功能區由N-末端的細胞毒域和C-末端的受體結合域組成。Claudin-3作為CPE的受體與其結合，CPE結合在Claudin-3的第二個細胞外環。將從銅綠假單胞菌外毒素（pseudomonas aeruginosa exotoxin）中提取的蛋白合成抑制因子PSIF與CPE的C-末端（C-CPE）融合形成Claudin-3靶向分子C-CPE-PSIF。此分子能識別細胞極性，且腫瘤內注射C-CPE-PSIF能抑制腫瘤生長。所以，C-CPE可能成為藥物輸送和腫瘤治療的一個新分子[21]。研究證實，C-CPE與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）融合后可抑制卵巢癌細胞生長，CPE片段可能成為Claudin靶向治療的工具[22]。實驗中利用Claudin-3 siRNA可抑制卵巢癌小鼠腫瘤的生長及轉移。因此，siRNA 介導的Claudin基因沉默也是潛在的抗腫瘤藥物[23]。Claudin靶向治療可能使NSCLC的治療取得突破性的進展[24]。

綜上所述，Snail和Claudin-3的表達與NSCLC的發生、發展密切相關，可以作為判斷NSCLC淋巴結轉移能力的生物學指標，對腫瘤預后的判斷有一定的參考價值。同時，在腫瘤的靶向治療中具有潛在應用價值。