清熱解毒方改善膿毒癥大鼠臟器功能的比較

楊 靜，劉洪斌，李東華

天津市中西醫結合急腹癥研究所（天津 300100）

膿毒癥是指由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其病原體包括細菌、真菌、寄生蟲及病毒等。膿毒癥病情兇險，病死率高。近年來，抗感染治療和器官功能支持技術取得了長足的進步，但病死率仍高達30%～70%[1]。本文所研究的清熱解毒方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草等組成，經過長期的臨床和科研應用，具有良好的療效[2]。本研究重點探討該方對膿毒癥大鼠多器官衰竭的改善作用，進一步探討其治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康Wistar大鼠88只（由天津市實驗動物中心提供，動物飼養合格證為（07311），雌雄各半，體質量（250±30）g。標準顆粒飼料喂養。隨機分為7組：正常對照組（20只）、模型組（20 只）、QR1 組（9 只）、QR2 組（9 只）、血必凈組(10只)。

1.2 主要實驗儀器 流式細胞儀（BD Calibur, 美國），電子天平（SARTORINS,德國）。

1.3 相關試劑 熒光抗體：P-selectin Mouse anti-Human Monoclonal Antibody-LS-C44841，Integrin，Beta 3 Hamster anti-Mouse Monoclonal Antibody-LS-C44643均購自LIFESPAN BIOSCIENCES。

1.4 受試藥物 清熱解毒方1（QR1）、清熱解毒方2（QR2）由華西醫科大學藥學院提供，批號：201008。該方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草等按不同比例配伍而成，定容至相當于3 μg·mL-1生藥（配比見表1）。血必凈注射劑由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等中藥材提取物組成，主要成分為紅花黃色素A等。

1.5 模型制備與給藥方法 實驗前12 h禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。開腹，分離盲腸，在距其末端2 cm處以1號絲線結扎, 再用18號針頭在盲腸末端穿孔, 將盲腸放回腹腔后逐層關腹。連續觀察72 h。各給藥組于術前1 d 給藥，連續給藥3 d，1次/d灌胃，劑量為24 μg·kg-1生藥。對照組及模型組為等量生理鹽水灌胃。

表1 清熱解毒方不同成分配比表

1.6 檢測指標 治療72 h，各組動物經腹主動脈取血，部分用EDTA 抗凝，離心分離血清-30 ℃凍存；其余血液肝素鈉抗凝。樣品制備方法：每管加入熒光抗體各10 μL，抗凝血5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，加入PBS 稀釋的1%多聚甲醛1 mL，4 ℃靜置30 min后進行流式細胞術檢測。

1.7 統計學處理 計量資料以均值±標準差(x±sd）表示，數據采用SPSS 11.5統計軟件包進行方差分析，采用LSD 法行兩兩比較，P ＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 0～72 h 各組大鼠死亡率 正常對照組大鼠無一死亡；模型組，造模3 d 后死亡率為65%，QR1 組死亡率為11.1%，QR2 組死亡率為55.60%，血必凈對照組死亡率為50%。詳見表2。由此可見，就提高模型大鼠的存活率而言，QR1 有較好的療效。QR2組為敗醬草缺如組，此結果提示敗醬草在清熱解毒方改善大鼠存活率方面發揮了重要作用。

2.2 血小板表面蛋白CD62P 的表達 與正常組相比，膿毒癥模型組血小板表面顆粒CD62P的表達陽性率有明顯的升高，而QR1 在給藥的3 d 后可以降低CD62P 陽性血小板的百分率，此效果優于QR2組。詳見表3。

表2 治療后0～72 h各組大鼠死亡率比較

表3 治療72 h后大鼠血小板CD62P的變化(x±sd）

2.3 腎功能變化 模型組動物在造模后血清中的BUN、Cr 水平較之正常對照組顯著增高(P ＜0.05)；各治療組與模型組相比BUN、Cr的表達水平均有不同程度的降低，治療組間差異不顯著。詳見表4。

表4 治療3 d后大鼠血中BUN/Cr的變化(x±sd）

2.4 肝功能變化 造模后，模型組動物血清中反映肝功能的指標AST、ALT 水平以及AST/ALT 比值較正常對照組均有顯著增高(P ＜0.01)；給藥以后，各組檢測指標都有不同程度的降低：QR1、QR2、血必凈組可以明顯降低AST水平（P＜0.05)，組間比較血必凈組效果最好，QR1 組與QR2 組無統計學差異；QR1組與血必凈組可以降低ALT 表達水平，血必凈效果較好；給清熱解毒方治療后，各配伍組AST/ALT比值均有所降低，血必凈組無此作用。詳見表5。

表5 治療3 d后大鼠血中ALT、AST的變化(x±sd，U/L）

3 討論

膿毒癥是由于機體對微生物感染、創傷或燒傷等反應引起的一種嚴重綜合征，常伴隨SIRS和多器官功能障礙。盡管近年來在膿毒癥的基礎研究和臨床治療上都取得了可喜的進步，但其死亡率仍居高不下。隨著病情的進展，膿毒癥所導致的各器官可逆性的功能障礙（表現為線粒體攝氧和氧化功能障礙，引起ATP 的合成障礙和快速耗竭）轉變為不可逆性器官衰竭是病人致死的主要原因[1]。

中醫學認為，膿毒癥的主要病因、病機可概括為邪毒入侵(嚴重感染、中毒、休克等)或各種創傷(外傷、燒傷、燙傷、手術等)導致正邪交爭、正氣耗傷、邪毒阻滯、正虛邪實。進一步分為毒熱證，瘀血證，急性虛證等。目前中醫藥治療膿毒癥側重于清熱解毒、通腹瀉下、活血化瘀等方面[2]。本研究所采用的清熱解毒方由金匱瀉心湯加減衍化而來，由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草組成，兼有通里攻下和清熱解毒雙重功效。血必凈注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等中藥材提取物組成，主治全身炎性反應綜合征、多器官功能失調綜合征。

大鼠CLP模型是目前公認的臨床相關性較強的膿毒癥模型。本研究通過此模型的建立，旨在觀察清熱解毒方對膿毒癥大鼠受損臟器如肝、腎以及血液系統的治療效果，探討其作用機制，為臨床更加合理應用、研發新藥提供實驗依據。

首先我們著眼于動物的整體生存狀態，研究發現，CLP 模型大鼠在0～24 h 的死亡率為35%，24～48 h 內死亡率為46%，48～72 h 內無死亡。給予QR1 治療后72 h 死亡率為11.1%。與之相反，QR2組以及血必凈組死亡率均較高。值得注意的是，各組大鼠的死亡時間主要集中于48 h之內，這說明膿毒癥早期所導致的急性炎癥反應是導致死亡的重要原因。隨著時間的發展以及有效的臨床干預，一般認為，膿毒癥后期免疫抑制而導致的感染與病程后期病人的死亡密切相關[3]。QR2 組為敗醬草缺如組，可見，本實驗中敗醬草在清熱解毒方改善大鼠存活率方面發揮了主要的作用。敗醬為敗醬科植物黃花敗醬、白花敗醬的干燥全草；性微寒，味辛、苦；入胃、大腸、肝經；具有清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛之功效。敗醬草具有很高的藥用價值，主要表現在抗炎方面，如治療慢性盆腔炎、結腸炎、前列腺炎等。推測其改善生存率的機制很可能與其具有較強的抗炎作用密切相關。

眾所周知，活化血小板是血栓的主要成分，也是引起血栓的主要原因。研究發現：膿毒性休克的患者血液流變學和血小板功能均發生異常，隨著病情加重血小板功能障礙加劇，血小板功能障礙在MODS發病機制中起更加重要的作用[4-6]。本研究發現：清熱解毒方QR1組能夠降低血小板CD62P的表達，QR2 組（敗醬草缺如組）效果較差，這一變化與大鼠的存活率相對應。推斷膿毒癥時病原和活化的炎性介質激活了凝血系統，直至出現彌散性血管內凝血與死亡率有著密切的聯系，而血液系統的改善與否直接關系了治療的成敗。

國內外研究證實，膿毒癥是急性腎損傷的重要的危險因素，同時膿毒癥并發急性腎衰將有25．3%的死亡率[7]。更有學者認為，膿毒癥大鼠早期就存在有腎功能損害[8]。本研究結果發現，清熱解毒不同配伍組都可以有效的改善膿毒癥大鼠受損的腎臟機能。

肝臟作為人體的重要組織器官，參與機體的代謝、解毒、排泄、凝血等多種生理功能。血清天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)是慢性肝病診斷中重要和敏感的檢測指標。研究表明，觀察兩者的變化和比值，對了解肝病的嚴重程度和判斷預后有一定價值[9-11]。本研究中，膿毒癥模型大鼠的AST 和ALT 的值顯著升高，給藥后各清熱解毒方組都顯著降低了AST/ALT 比值；其中血必凈組和QR1(大黃:黃芩:白頭翁:敗醬草=4:4:6:6)組對損傷的肝細胞有廣泛的修復作用，表現為AST水平和ALT 水平顯著下降；而QR2 組只降低了AST的表達水平，即改善線粒體的功能；本實驗進一步證實了敗醬草在清熱解毒方中的保肝作用。

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