Notch1和Jagged1表達與腎透明細胞癌發病及預后

吳科榮，許 樂，張 立，侯 君，林宗明，蔣照輝

1.浙江省寧波市第一醫院泌尿腎病中心（寧波315000）

2.復旦大學附屬中山醫院（上海200032）

我們曾經報道了Notch 通路中重要配體蛋白Jagged1的表達與腎癌的分級、分期、腫瘤大小有關，Jagged1 的表達水平可以作為早期腎癌的獨立預后因子[1]。本研究綜合利用免疫組化和Western blot的方法，選擇2003年3月—2008年11月在復旦大學附屬中山醫院行腎癌手術，術后病理證實為腎透明細胞癌的病例共計129 例，以更大樣本量進一步檢測Notch1 與Jagged1 在腎癌組織及正常腎組織中的表達,并探討蛋白表達與臨床病理特征的關系，以及Notch1與Jagged1作為腎癌預后判斷指標的價值。

1 對象與方法

1.1 一般資料 本組129例中，男84例，女45例；年齡27～83 歲，平均55.5 歲。采用腎根治術122 例(94.6%)，腎部分切除術7 例(5.4%)。腫瘤按TNM(2002 AJCC)分期：Ⅰ期81 例, Ⅱ期17 例，Ⅲ期24例, Ⅳ期7例。腫瘤按Fuhrman分級：1級53例，2級54 例，3 級18 例，4 級4 例。腫瘤大小1.5～15 cm，平均5.3 cm。平均隨訪時間47.2個月。37例術后出現復發(28.7%)，92例未發現腫瘤術后復發(71.3%)。86例無瘤生存，6 例帶瘤生存。死亡37 例，其中31 例死于腫瘤，6例死于其他疾病。

1.2 研究對象 本項研究經由復旦大學倫理委員會批準（NO.2008-98）。129例均取術后腎癌組織切片標本，用于免疫組化染色，其中33例同時在距離癌組織邊緣5.0 cm 以外的正常組織處取材作為對照。組織標本均采用10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續切片。其中8例在術中即刻采集新鮮腎癌標本及遠離腫瘤的正常腎組織，用作Western blot檢測。組織在經病理檢查，迅速導入液氮腫瘤庫保存。

1.3 Western blot 腎癌腫瘤組織及相應正常組織共8 例，每20 mg 組織加入0.25 mL RIPARIPA 緩沖液，加入蛋白酶抑制劑混合物，組織勻漿使細胞充分裂解，離心獲取總蛋白。以Bradford法作蛋白定量，每個樣本取100 μg蛋白，加入上樣緩沖液，沸水浴中5 min，行7%SS-PAGE凝膠電泳130 V 2 h后轉硝酸纖維素膜，90 V 90 min。轉磨結束后取下硝酸纖維素膜，5%牛奶封閉1 h，TBST 清洗，加入一抗（分別為兔抗人Notch1 多克隆抗體ab27526 ，Abcam，UK；羊 抗 人Jagged1 多 克 隆 抗 體sc-6011，Santa Cruz，USA）4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗檢測。

1.4 免疫組化染色 采用EV二步法染色。常規脫蠟、脫水后，3%新鮮雙氧水避光孵育30 min滅活內源性過氧化物酶；熱抗原修復(抗原修復液為pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液)。滴加一抗（分別為兔抗人Notch1多克隆抗體ab27526，Abcam，UK；羊抗人Jagged1 多克隆抗體sc-6011，Santa Cruz，USA），室溫下孵育1 h，洗滌后再分別滴加辣根過氧化物酶標記的二抗。DAB 顯色、蘇木素復染、封片。用已知乳腺導管癌陽性切片做陽性對照，以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.5 染色結果判定 染色片均由3位獨立的觀察者進行染色評價，觀察者對病例信息均無任何了解。染色強度和染色程度的評價依據為既往的文獻[2]報道：先在低倍鏡下隨機選擇3個視野（×40），計數100 個腫瘤細胞陽性百分比，定義細胞無染色為陰性，1%～20%細胞染色為1分，21%～60%細胞染色為2分，61%～100%細胞染色為3分。通過觀察高倍鏡（×200）下腫瘤細胞染色強度，定義不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，深褐色為3 分。定義免疫染色評分為上述2 項指標之和，并定義0～3分為蛋白低表達，4～6分為蛋白高表達。

1.6 統計學分析 所有數據均選用SPSS 15.0軟件行統計學分析。蛋白表達與臨床病理參數的關系采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 曲線和Cox Regression 模型。P ＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot Jagged1蛋白在6例標本的腎癌組織中的表達水平（6/8，75.0%）高于在配對的正常組織中的表達，Notch1 蛋白在7 例標本的腎癌組織中的表達水平（7/8，87.5%）高于在配對的正常組織中的表達（圖1）。總體上，Jagged1 蛋白及Notch1 蛋白在腎癌組織中的表達高于其周圍正常腎組織中的表達。

2.2 免疫組化染色 Notch1、Jagged1在腎癌組織中免疫組化染色主要表現為腫瘤細胞胞膜染色和（或）胞漿染色，小部分腫瘤細胞胞核亦染色（圖2、圖3）。Notch1、Jagged1在正常腎組織中的陽性表達率分別為36.4%(12/ 33)、42.4%(14/ 33)，在腎癌組織中的陽性表達率分別為95.3%(123/129) 、93.0%(120/129)。Notch1 及Jagged1 在腎癌組織中的表達均高于其在正常腎組織中的表達(P＜0.05)。

圖1 Western blot顯示Notch1蛋白及Jagged1蛋白在腎癌組織及正常腎組織中的表達1T～8T分別代表8例腫瘤組織，1N～8N分別代表8例正常腎臟組織

圖2 腎透明細胞癌組織Notch1免疫組化染色（×200）

圖3 腎透明細胞癌組織Jagged1免疫組化染色（×200）

2.3 Notch1、Jagged1 表達與腎癌臨床病理的相關性 隨著腎癌病理分級和臨床分期的增高，Notch1和Jagged1的表達水平都增高。Notch1和Jagged1的表達水平還與腫瘤大小有關：在直徑≥5 cm的腫瘤中的表達要高于在直徑＜5 cm 的腫瘤中的表達。兩者的表達水平在不同年齡和不同性別的病例中無顯著差異（表1）。

2.4 Notch1、Jagged1表達與預后的關系 腫瘤復發與Notch1、Jagged1表達水平有關。復發組Notch1 和Jagged1蛋白的表達水平均高于未復發組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 Notch1、Jagged1 的表達與臨床病理參數間的相關分析

通過Kaplan-Meier 曲線進行分析，總生存率（overall survival, OS）和無病生存率（disease free survival, DFS）均與Notch1、Jagged1 表達水平有關。低表達Notch1的病例組，其OS和DFS明顯優于高表達Notch1 的病例組(P=0.028, 0.032)；低表達Jagged1的病例組OS和DFS明顯優于高達Jagged1的病例組(P ＜0.001,＜0.001)（圖4）。單因素分析顯示，Notch1 與Jagged1 表達水平對腎透明細胞癌患者生存率影響有統計學意義。

通過Cox Regression模型，納入包括年齡、性別、腫瘤大小、分期、分級及Notch1、Jagged1表達水平等因素進行分析，發現Jagged1表達水平可以作為影響腎透明細胞癌預后的獨立預后因子(P=0.035,0.028) (表2、表3)。而Notch1 作為獨立預后因子證據尚不充分(P=0.917，0.859)(表2、表3)。

3 討論

圖4 A、B：低表達Notch1的病例組，其總生存率（OS）和無病生存率（DFS）明顯優于高表達Notch1的病例組(P=0.028, 0.032)；C、D：低表達Jagged1的病例組其總生存率（OS）和無病生存率（DFS）明顯優于高達Jagged1的病例組(P<0.001, <0.001)

表2 多因素Cox風險模型分析總生存率結果

表3 多因素Cox風險模型分析無病生存率結果

腎透明細胞癌是泌尿系統最重要的惡性腫瘤之一，其發生發展與Von Hippel—Lindau（VHL）抑癌基因失活有關。針對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受體的分子靶向治療，目前已經成為轉移性腎癌的一線治療方法，但仍存在有效率低、不良反應明顯等缺點[3]。隨著對腎癌分子基因基礎的進一步了解，更多的信號通路揭示與腎透明細胞癌發病有關，對這些通路的研究，不僅可以進一步完善腎癌發病機制，而且可能提供其他的治療靶向[3]。

Notch通路是進化上十分保守的通路，其受體有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配體包括Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4。當受體與配體結合后，受體的胞內段NOTCHIC釋放，進入細胞核并啟動下游靶基因如Hes基因等的表達。

Notch 通路廣泛表達于從無脊椎動物到哺乳動物等多個物種，在細胞的分化、增殖、凋亡、遷徙、粘附等生命活動中都起到重要作用。異常的Notch信號已經證明與許多腫瘤的發生有關。目前Notch與腎透明細胞癌的關系尚不十分明確，研究少且意見不一。Sun 等[4]的研究結果認為，Notch 在腎透明細胞癌中低表達，而Rae[5]、Zhao 等[6]則發現，腎透明細胞癌中Notch3、Jagged1 高表達。Sj?lund 等[7]在腎透明細胞癌細胞株中測得Notch通路各組成蛋白高表達，這種表達與經典通路中VHL、HIF-1a、HIF-2a的表達是相對獨立的。

在本項研究中，我們通過Western blot和較大樣本的免疫組化結果發現，Notch1與Jagged1在腎透明細胞癌組織中存在表達，其陽性表達率高于在正常腎組織中的表達，并且發現Notch1和Jagged1的表達水平與腫瘤的病理分級、臨床分期和腫瘤大小均有關。這些結果有力提示，Notch通路在腎透明細胞癌的發生發展中起到致癌的作用。

Notch通路的致癌作用可能與其在維持干細胞功能、抑制細胞分化、抑制細胞凋亡中的功能有關[8]。另外，可能還與其在腫瘤血管生成中的作用有關。Patel 等[9]測定Notch 通路的配體之一DLL-4 在透明細胞癌中的表達，是在正常腎組織表達程度的9倍，并且這種表達與VEGF的表達正相關。Zeng等[10]報道了高表達Jagged1 頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)細胞更容易形成豐富的腫瘤血管和更大的瘤體。而Sj?lund等[7]采用γ分泌酶抑制劑抑制腎癌Notch 通路后發現，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKi）p21 和p27 水平的上調，揭示Notch致癌的機制還可能與抑制p21和p27有關。

在腎癌預后判斷方面，國內外學者在解剖水平、臨床水平、組織學水平和分子水平上發現了眾多影響因素。其中既有獨立的預后因素,也有協同作用的多個因素。在分子水平，研究較多的預后因子有HIF-1α、CAIX、VEGF 等。在本項研究中，我們探討了Notch1 和Jagged1 對腎癌預后的影響。單變量分析揭示Notch1 與Jagged1 表達水平對腎透明細胞癌患者生存率影響均有統計學意義，高表達Notch1或Jagged1預示腎癌不良預后。而在多變量分析中，Jagged1 的表達水平可以作為判斷腎透明細胞癌預后的獨立預后因子，顯示出其在臨床上腎癌預后判斷中的意義和價值。國外有人報道，Notch通路在乳腺癌的發生發展中起著促癌的作用，并且Jagged1高表達提示乳腺癌患者的不良預后[11]。而在轉移性前列腺癌中，Jagged1高表達的前列腺癌病例的腫瘤復發概率比Jagged1 低表達的前列腺癌病例高[12]。結合我們的結果，我們推測，Notch 通路的活化經由Jagged1介導并與惡性腫瘤形成及疾病進展有關。

與Jagged1不同，Notch1作為獨立預后因子依據尚不足。這其中的原因有：⑴Notch通路有多個受體和配體，而Notch1與Jagged1并非嚴格的一一配對關系。⑵Notch 與其他通路之間存在的交集對該通路的調控和影響。⑶病例數量不足，因此需要更加大樣本的研究進一步證實Notch1 在腎癌預后判斷方面的作用和價值。

本研究通過使用Western blot 及免疫組化的方法，證實了Notch 通路重要組成蛋白Notch1 和Jagged1在腎透明細胞癌中高表達，并與腎透明細胞癌發生發展有關。單因素和多因素生存分析顯示兩者（尤其是Jagged1）對腎癌預后的影響，為指導臨床上腎癌預后判斷提供了新的指標。Notch 通路作為腫瘤治療靶點待進一步探索，具有廣闊的研究前景和價值。

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