流式細胞術在臨床檢驗中的應用

張 韞，楊 鑫，李 忻

（中日友好醫院臨床醫學研究所 中心實驗室,北京 100029）

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是近代細胞生物學、分子生物學、分子免疫學、流體力學、激光技術、電子計算機技術等高度結合和發展的結晶，是一種在功能水平上對單細胞或其他細胞粒子、抗原物質進行快速檢測分析和分選的技術[1]。FCM結合現代單克隆抗體技術，可同時鑒別單個細胞上的多種參數定量定性分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點。使用FCM能夠快速分析單個細胞或粒子的多種特性，既可以定性也可以定量，尤其適用于大量樣品檢測，已在臨床檢驗工作中得到廣泛應用。FCM的檢測分析已涉及到腫瘤學、免疫學、血液學、微生物學、細胞生物學、遺傳學等學科[2]。筆者對FCM在臨床檢驗工作中的應用作一綜述。

1 FCM的工作原理及分型

FCM的結構一般分為5部分：①流動室及液流驅動系統；②激光光源及成形系統；③光學系統；④信號檢測、存貯、顯示、分析系統；⑤細胞分選系統[3]。FCM的特點：①快速，最高每秒可測數十萬個細胞；②進行多參數相關測量，可根據測量信息對細胞進行分選。其原理是把經熒光染料標記過的細胞樣品制成單細胞懸液，由氣壓裝置送入流動室，流動室由供試品管和鞘液管組成，鞘液管充滿流的鞘液，鞘液流與供試品流壓力不等，當兩者壓力差達到一定程度時，鞘液裹挾著供試品流迫使細胞有序地排列成單列，逐個通過噴嘴進人這些染料將在通過激光檢測區時受激光束激發，產生散射光和熒光信號，通過一些波長選擇通透性濾光片，用不同波長的散射光和熒光信號區分開來。信號的強弱與細胞內待測組分的含量呈正比。熒光信號和散射光信號經過光電倍增管和光電探測器接收后轉換成電脈沖，送入計算機處理，應用不同的分析軟件可分析樣品的各種參數，最后以直方圖或二維圖的形式顯示出來，還可以用不同的熒光標記物進行單參數、雙參數、甚至多參數的分析[4]。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可同時測定一個細胞上的多種不同的特征，如細胞大小、DNA含量、細胞表面抗原表達、癌基因蛋白等。

FCM一般分為科研型和臨床型兩種。科研型FCM功能齊全，分析靈活，但操作比較繁瑣，必須由經過正規培訓的專業技術人員進行操作；臨床型FCM易于操作，穩定性好，分析速度快，適合在臨床實驗中應用。對某種特征的細胞，還可利用科研型FCM的分選功能將其分選出來，進行培養或其他處理，做更深入的研究[5]。

2 FCM在臨床中的應用

2.1 在腫瘤學中的應用

FCM在腫瘤學方面的應用主要是利用DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作。惡性腫瘤的早期診斷是提高治愈率和生存率的關鍵，良惡性腫瘤的鑒別診斷對于確定臨床治療方案具有決定性作用。迄今為止病理形態學診斷一直被視為腫瘤診斷的“金標準”，但由于某些腫瘤，特別在早期缺乏客觀明確的診斷指標，不能提高診斷的正確率[6]。

FCM的出現給腫瘤的病理學診斷帶來了飛躍，特別是用FCM分析細胞DNA含量，分辨率高、精確度好，可為判斷腫瘤的生物學行為提供客觀而準確的資料，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。癌前病變是指某些具有癌變潛能的病變，正確識別癌前病變對早期診斷和預防惡性腫癌具有重要的實際意義。然而臨床上所謂癌前病變所包括的實際上是一大組生物學行為迥異的病變，其中一小部分具潛在癌變可能，而大部分完全是良性病變，因此要用病理形態學手段將其區別開來。只有那些不典型增生或稱異型增生的上皮具癌變潛能，為了進一步區別不典型增生上皮癌變潛能的大小，通常根據其增生程度和形成表現將其分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級，分級越高，惡變可能性越大。DNA非整倍體的出現可能是癌前病變發生早期癌變的一個重要指標。FCM可精確定量DNA含量的改變，即檢測出DNA非整倍體的出現，并將其作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，從而對癌前病變的性質及發展趨勢做出評估，有助于癌變的早期診斷[7]。其具體方法是先將實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，再用熒光染料（碘化吡啶PI）染色后對細胞的DNA含量進行分析，最后將不易區分的群體細胞分成3個亞群 （G0/G1期、S期、G2期），DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力證據[8]。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。

FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，在腫瘤化療方面的意義尤為顯著。臨床工作人員可根據細胞周期各時相的分布情況，結合化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化，及時調整治療方案，選取有效藥物以使對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果[9]。

2.2 FCM在免疫學中的應用

利用抗原抗體特異性反應原理，將不同單克隆抗體設法帶上各種熒光染料作為熒光標記（熒光探針），這種熒光探針與單克隆抗體能牢牢結合。當細胞被激光器發射的激光照射后，細胞膜的抗原抗體復合物上的熒光探針可以發射出不同光譜的激發熒光，帶熒光探針的單克隆抗體與細胞表面相應抗原的結合的繼發熒光量轉換成電信號，這就代表了細胞表面的抗原量。這些熒光通過FCM的識別和分辨，從而實現對細胞表面抗原的定量檢測[10]。細胞免疫反應一般分2種：（1）直接免疫反應：即細胞表面抗原與帶熒光探針的單克隆抗體特異結合的免疫反應；（2）間接免疫反應：細胞表面的抗原與單克隆抗體結合，帶熒光的第二抗體又與抗體結合，也使這個抗原-抗體復合物也帶上熒光探針[11]。

機體免疫狀態是機體是否罹患疾病的重要指標，目前多采用FCM來監測機體的免疫狀態，其中最重要的指標是 T、B和 NK淋巴細胞的水平。T細胞主要包括 Th和Ts細胞亞群。CD3細胞代表外周血中總的成熟 T細胞，理論上應約等于CD4+細胞和CD8+細胞的總和。但我們檢測患者T細胞及其亞群時，往往出現CD4+加 CD8+細胞之和大于CD3的情況。這是因為CD4+細胞其實包括兩部分：CD3+/CD4+細胞（真正的 Th細胞）和 CD3-/CD4+細胞（非Th細胞）；CD8細胞也包括兩部分細胞：CD3+/CD8+細胞（真正 Ts細胞）和 CD3-/CD8+細胞（非 Ts細胞）。而CD3-/CD8+細胞又可以分為兩組：一組為CD3-/CD8+/CD（16+56）+細胞（即 NK細胞的一部分）；另一組為 CD3-/CD8+/CD（16+56）-（一群未知細胞）。由此可見，真正的 Th細胞是CD3+/CD4+細胞，真正Ts細胞是 CD3+/CD8+細胞。若使用CD4或CD8單標單抗或CD4與CD8雙標抗體來檢測 Th和 Ts，而不用 CD3抗體進行限定，測出的結果必然會偏離真實值。尤其當患者NK細胞明顯增加時，會使CD4細胞和CD8細胞的總和遠大于CD3+細胞。因此，一定用三色熒光標記才能分析真正的輔助性T細胞和抑制性T細胞。首先在淋巴細胞中識別出CD3細胞，然后在 CD3細胞中再區分 CD4+和 CD8+細胞[12]。

自然殺傷細胞（NK），又稱裸細胞，因其表面沒有類似T細胞和B細胞的表面標志。后來隨著免疫力學的發展，發現了 NK細胞的一些表面標志，如CD16、CD56等，但單用 CD16和CD56的抗體無法正確鑒定出 NK細胞，因此必須使用 CD（16+56）抗體。這里還有一點必須引起足夠重視，即 NK細胞一定是 CD3陰性表達細胞。所以CD3-/CD（16+56）+細胞才是真正的 NK細胞[13]。

B細胞的表面標志是CD19，理論上CD3-/CD19+細胞才是真正的 B淋巴細胞。但實際檢測中，CD3+/CD19+細胞很少，可以忽略不計，所以 CD19+細胞就是 B淋巴細胞[14]。

FCM與單克隆抗體結合，對細胞表面和細胞內抗原、癌基因蛋白及膜受體的定量檢測取得很大的進展，克服了普通免疫學方法難以準確定量的不足。這一技術對于人體細胞免疫功能的評估有重要意義。通過檢測各種免疫細胞的表面標志及細胞內各種細胞因子等，通過對患者淋巴細胞各亞群數量的測定來監控患者的免疫狀態，指導治療。FCM通過對人白細胞抗原配型的測定可以為異體干細胞移植患者選擇出最合適的供體并進行骨髓或器官移植后免疫狀態的監測[15]。此外，用FCM檢測紅細胞、粒細胞抗體及血小板減少性疾病，均有檢測速度快、靈敏度高、特異性強的優點[16]。

2.3 FCM在血液學中的應用

在臨床診斷中，一般通過采集血液或者骨髓為標本進行診斷，因為血液或者骨髓的采集比較方便，而且采集的標本呈懸浮狀態，易于FCM分析、分選等，因而血液學也是FCM重要的應用領域之一[17，18]。

FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準確性可達到90%左右。微小殘留病變 （minimal residual disease，MRD）是白血病復發的主要根源，FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，及早發現后采取措施避免復發。而且測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。急性白血病的多耐藥基因也常用FCM檢測，FCM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮mRNA的表達產物P糖蛋白及其活性（作為藥物的排出泵,降低細胞內藥物濃度），可以更直接的反映耐藥程度[19～21]。

網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標。FCM通過某些熒光染料 （吖啶橙等）與紅細胞中RNA結合,定量測定網織紅細胞中RNA,得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有報道認為FCM比目測法的精確度更高。此外,FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度,對紅細胞增殖能力的判斷很有意義,為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據[22，23]。

此外，血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可以產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體（IgG、IgA或IgM分子），用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，運用FCM能檢測出血小板相關抗體含量。該方法用于該病的診斷及治療監測具有檢測速度快、靈敏度高的優點[24]。

2.4 FCM在臨床微生物檢測中的應用

FCM快速、靈敏以及可以同時進行多參數分析的優點，使其在臨床微生物檢測中的作用受到越來越多的關注。通過熒光染料標記，不僅可以檢測病原菌、毒素和血清抗體，還可用于抗生素敏感性試驗，對抗生素后效應、細菌耐藥的異質性等進行分析。FCM既可用于檢測受染細胞內的病毒抗原,也可檢測受染細胞表面的病毒抗原。利用可特異性識別細胞表面或細胞內抗原的單克隆抗體,FCM可快速檢測并定量受染細胞。常用的有直接和間接熒光抗體技術,前者用熒光標記特異性單克隆抗體,后者用未標記的一抗與受染細胞中的抗原結合,然后再將熒光標記的二抗與一抗結合。由于FCM檢測的是單個細胞,因此FCM檢測受染細胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標本以及經酶消化過的組織細胞。同時由于FCM為多參數分析,因此將其用于病毒檢測具有以下優點：可在單個細胞中同時獲得多個分析參數；能定量檢出受染細胞。當用不同熒光染料標記不同的病毒抗原特異性抗體或將特異性病毒抗體與不同大小的乳膠顆粒相聯時,FCM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原。這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體混合感染的檢測[25]。

FCM體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過FCM檢測染料與病原體結合后發出的不同熒光強度，間接反映病原體的活性和功能狀態，進而幫助判斷病原體對抗生素的反應性。用于研究抗菌效應的熒光染料主要有2大類：（1）標記DNA和RNA的染料，如碘化丙啶（PI）、溴化乙錠（EB）等；（2）反映代謝活性或結合蛋白的探針，包括膜電位敏感性染料、異硫氰酸熒光素（FITC）等。這些物質的選擇與其激發與發射特性有關，同時也與抗生素的作用機制有關[26]。近年來,FCM用于細菌的藥敏效應研究已有較大發展,FCM與熒光染料的聯合運用可判斷細菌活力和功能狀態,由于速度快,該方法已被建議用作臨床實驗室的常規藥敏試驗[27]。

3 展望

FCM以其分辨率高、分辨細胞數量大、參數多、準確性高、速度快等優點而廣泛應用于生物醫學研究中，并逐步成為醫學臨床檢驗領域中極具發展潛力的高技術平臺。隨著流式細胞分析技術與方法的迅速發展，FCM在臨床的應用范圍也不斷拓展，并將成為推動臨床醫學發展的重要手段之一。

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