變應性鼻炎基因治療研究與展望

章如新

·變態(tài)反應性疾病·

變應性鼻炎基因治療研究與展望

章如新

變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 是一種多基因遺傳和環(huán)境因素共同影響的鼻變態(tài)反應性疾病。流行病學及遺傳學證據表明，該病具有多基因調控的特征, 某些相關基因在其發(fā)病中發(fā)揮重要作用。隨著基因組學研究的進展及AR相關基因的不斷深入研究，AR的基因治療研究已成為學科的前沿領域。

1 基因治療基本原理

基因治療(gene therapy)是指利用分子生物學方法將目的基因導入靶細胞，使之表達目的基因產物，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而使疾病得到治療。從廣義上而言，基因治療包括從DNA水平所采取的治療措施和技術。基因治療的研究隨著科學技術的不斷進步和科研相關問題的逐步解決，而不斷深入發(fā)展和延伸。基因治療的基本原理有基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活及免疫調節(jié)等。

1)基因置換。就是用正常的基因原位替換病變細胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術原因尚難以直接用于臨床，多數是用于動物胚胎實驗研究。

2)基因修正。是指將缺陷基因的突變堿基序列糾正，而正常序列予以保留。這種基因治療方式最后也能使缺陷基因得到完全恢復，操作上要求高，技術難度大。

3)基因修飾。又稱基因增補或基因補充，即將目的基因導入缺陷細胞或其他細胞，使目的基因的表達產物能夠修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得到恢復或加強。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細胞內。目前基因治療大多采用這種方式。

4)基因失活。即利用核酶等反義技術及其RNAi技術能夠特異性地封閉、阻斷基因異常表達，抑制一些有害基因的表達，以達到治療疾病的目的。

5)免疫調節(jié)。將抗體、抗原或細胞因子基因導入機體，調節(jié)機體的免疫狀態(tài)，達到預防和治療疾病的目的。

2 AR基因治療的策略

2.1 利用芯片技術篩選發(fā)現(xiàn)AR相關基因 AR是一種多基因調控的變應性疾病。遺傳學研究已發(fā)現(xiàn)，在染色體11q13、12q、10q11.2、1q42-43、6p22-24等存在AR相關基因[1]。基因功能涉及組織相容性抗原復合體，細胞因子白細胞介素4(interleukin 4, IL-4)，IL-13及受體等，趨化因子 RANTES、MCP-1、EOTAXIN及受體等,免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)等[2]。由于涉及不同種族人群，相關基因存在一定的差異性，如HLA-DRB1、DQA1、DQB1在AR中，等位基因位點存在相關性及多態(tài)性[3]。隨著人類基因組計劃的進展，人類已進入了這種大規(guī)模、大通量的基因研究時代。一些傳統(tǒng)的血清學診斷技術和分子生物學檢測技術，如以抗體為基礎的一些常規(guī)診斷技術方法和聚合酶鏈反應診斷技術雖然有一定的實用性和優(yōu)越性，但在大規(guī)模的遺傳病研究中，其實際應用還存在一定的局限性；而基因芯片由于其巨大的分析能力，極少的樣品用量，簡單、快速、高效的使用方式，能夠對個體生物信息進行高速采集和分析，在遺傳基因的研究中越來越受到重視。基因芯片技術也已應用于AR的研究中，利用基因表達譜芯片篩選差異表達基因，為進一步研究AR的診斷與治療提供基因水平的線索。我們利用基因表達譜芯片篩選了AR相關基因，研究發(fā)現(xiàn)國人AR患者中AR相關基因有趨化因子CCL-1、CCL-2、CCL-8、CCL-18、RANTES、eotaxin、血小板因子4(platelet factor-4，CXCL4) 基因等及趨化因子受體CCR2、CCR3、CCR4、CCR8、CX3CR1、XCR1等[4]。隨后，國外也利用表達譜芯片篩選出AR相關基因細胞因子有IL-4、IL-13及受體等，趨化因子CCL-2、CCL-3、CCL-8、 RANTES、eotaxin及CCR3、CCR4、MCP-1等，與我們的研究結果基本相一致[5]。

2.2 AR的基因調控網絡研究 遺傳學研究的不僅是相關基因，而且包括基因之間的調控關系。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA,miRNA)在基因表達中充當調控者的角色，在細胞分化凋亡、生物發(fā)育、疾病發(fā)生等方面均起重要作用[6]。miRNA是長約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，本身不具有開放閱讀框架，不編碼任何蛋白質，但廣泛存在于植物、線蟲甚至人類的細胞中,在生命活動中發(fā)揮重要調控作用[7]。它能在RNA代謝的多個層面對與其同源的底物進行調控，通過形成RNA誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex,RISC)與靶基因3′端非翻譯區(qū)不完全互補結合，誘導mRNA的切割降解、翻譯抑制或者其他形式的調節(jié)機制，從而抑制靶基因的表達[8]。目前為止，人類基因組內已發(fā)現(xiàn)的miRNA已有3 000個，它們調控約50%以上基因的表達，因此篩選疾病相關的miRNA分子及分析其調控網絡也成為遺傳學中的研究熱點和前沿。

我們利用miRNA芯片技術初步篩選了AR相關miRNAs，研究結果提示，hsa-miR-874、hsa-miR-143、hsa-miR-498、hsa-miR-187等在AR中存在差異表達。這些研究表明，差異表達的miRNA在AR基因調控中的作用[9]。近年，有研究者對新生兒臍帶血免疫球蛋白E及157種miRNA進行測定，發(fā)現(xiàn)在miRNA-21減少的新生兒中，其免疫球蛋白E明顯升高，且單核細胞表面TGFBR2分子表達升高，這一現(xiàn)象與兒童的AR相一致。這表明，某些miRNA可以作為疾病的預報器[10]。miRNA的作用方式是通過對轉錄后基因表達的調控，來實現(xiàn)生物學效應的。一條miRNA可能控制著成百上千基因的轉錄，因此miRNA很可能與疾病的發(fā)病相關。阻斷其表達，也許可以治療某些相關疾病。近些年發(fā)現(xiàn)的miRNA類似物的合成物又稱Antagomirs，可以阻斷miRNA靶基因，誘導miRNA靶基因的長時間基因沉默[6]。Mattesa等[11]對過敏體質BALB/c小鼠鼻內應用miRNA-126 Antagomirs，室內塵螨誘發(fā)小鼠呼吸道過敏反應，發(fā)現(xiàn)小鼠的Th2細胞相關反應減弱，氣道高反應性降低，嗜酸性粒細胞聚集減少，炎癥得到一定控制,這也進一步說明miRNA在疾病中的重要作用，及其基因類似物的治療前景。

2.3 基因調控的RNA干擾研究 RNA干擾研究是基因干預研究的重要實驗手段，其中包括miRNA干擾與小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。miRNA干擾通過將過表達miRNA載體轉染細胞或生物體內，引起目的miRNA大量過表達，導致一系列下游相關基因的表達發(fā)生改變。siRNA技術則因其對目的基因的特異性和高效性，可以使目的基因表達的抑制率達到90%，從而在疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[12]。Hosoya等[13]發(fā)現(xiàn)，STAT6 siRNA可以顯著抑制IL-4/TNF-α誘導的真皮成纖維細胞合成分泌eotaxin，從而抑制AR炎性因子的浸潤。因此，利用RNA干擾技術研究AR基因調控機制，是目前廣泛開展的課題。

2.4 調控Th1/Th2細胞平衡 Th2相關細胞因子和炎性介質在AR中發(fā)揮重要作用，因此，通過基因水平抑制Th2細胞功能，減少相應細胞因子和炎性介質的釋放，是治療AR的希望所在。如轉錄因子GATA3的反義寡鏈核苷酸，可以減少小鼠體內Th2型細胞因子的產生，降低氣道高反應性，減少嗜酸性粒細胞的浸潤[12]。IL-5的干擾siRNA，可以顯著降低氣道高反應性，降低支氣管灌洗液中extonin水平，以及肺組織中IL-5的水平[14]。同時，加大Th1型相關細胞因子的表達也是改變Th細胞平衡的方法之一，如卵清蛋白致敏小鼠內轉染重組基因，可以抑制Th2型細胞免疫反應，Th2相關細胞因子IL-4、IL-5、血清特定IgE水平、嗜酸性粒細胞肺含量均顯著降低，氣道高反應性得以抑制[15-16]。

3 AR基因治療研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)AR治療藥物,如抗組胺藥、糖皮質激素等仍是目前治療AR的主要方法，但僅能緩解部分癥狀，沒有從根本上解決AR的治療問題。因此，尋找新的治療方法，已成為科學工作者思考和努力的方向。近年來所開展的AR遺傳學研究表明，其發(fā)病與多種基因的異常表達有密切關系。利用基因芯片技術對AR患者基因表達譜進行研究，發(fā)現(xiàn)存在較多差異表達基因，其中有參與炎性反應、免疫應答、免疫調控等的相關基因[17]。Liu等[18]對AR患者外周血單核細胞進行基因表達譜的檢測，結果也進一步證實AR為多基因疾病。隨后又發(fā)現(xiàn)重組激活基因，多種趨化因子CCL8、CCR3、CCR4等基因在AR中高表達。這些高表達的細胞因子在Th2型細胞免疫反應、炎性細胞的趨化募集及脫顆粒中起著重要作用[19-20]。

作為一類多基因遺傳病，尋找AR關鍵致病基因并進行基因干預治療是AR治療的重要研究方向之一。目前國內外已有不少AR相關基因的研究，同時也開展了一些基因干預性治療研究。He等[21]將腫瘤壞死因子α融合基因的質粒注入AR小鼠的鼻黏膜細胞，可以減少嗜酸性粒細胞等炎性細胞。利用小干擾RNA技術干預P物質及其受體(NK1R)的基因表達是治療AR的一個新方向。我們用自行設計構建合成的SP-siRNA及NK1R-siRNA在AR動物模型中，通過鼻腔局部干預處理，研究發(fā)現(xiàn)SP-siRNA及NK1R-siRNA有效地抑制了鼻黏膜嗜酸性粒細胞的浸潤及多種炎性細胞因子的表達，抑制抗原誘導的肥大細胞脫顆粒及FcεRI介導的信號轉導，從而減輕鼻黏膜局部炎癥[22-23]。這些研究為AR的基因治療提供了新的思路。

4 AR治療展望

目前認為，AR的發(fā)病有多種相關基因參與，并存在基因調控機制。也許存在尚未被發(fā)現(xiàn)的某些AR特定關鍵基因，這些特定基因可能在某種內外環(huán)境的刺激下被激活或表達。基因的遺傳易感性、基因與內外環(huán)境因素的相互作用等尚有待進一步研究。AR基因治療的實驗研究才剛剛開始，尚需我們不斷探索和認識，而尋找AR的致病基因及基因調控機制的研究是AR基因治療研究的基本思路和方向。

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2012-10-15)

(本文編輯 楊美琴)

復旦大學附屬華東醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200040

章如新(Email：zhangruxin@hotmail.com)