沙眼衣原體主要外膜蛋白多表位重組DNA誘導小鼠體液免疫有效劑量的探討

饒品歡，石朝暉，李文姝，呂艷，陳向敏，朱珊麗，張麗芳

（1.溫州醫學院 微生物學與免疫學教研室、分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.平頂山市疾病預防控制中心 檢驗科，河南 平頂山 467000）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一類通過黏膜感染，嚴格胞內寄生的原核細胞型微生物，不僅是發展中國家感染性致盲的主要原因[1]，也是引起人類性傳播疾病的一種重要病原體。Ct持續性感染可導致女性慢性盆腔炎、不孕和異位妊娠等嚴重并發癥，同時Ct生殖道感染還能提高HIV和高危型HPV傳播的概率[2-4]。

抗生素對Ct生殖道感染具有很好的療效，但不能改善已經發生的病變，同時由于無癥狀性衣原體感染普遍存在，給預防Ct的感染和并發癥的發生帶來很大困難。因此研制安全有效的疫苗是控制泌尿生殖道Ct感染的最好方法之一。Ct主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）占Ct外膜蛋白的60%，是引起宿主免疫反應的主要靶抗原。抗原是誘導機體免疫反應的決定因素，而免疫劑量也影響免疫反應發生的強弱，由于表位是免疫反應的物質基礎，我們前期工作構建了含T、B細胞表位的重組多表位Ct MOMP168[5]，本研究則探討通過分子克隆技術構建成功的Ct多表位重組真核表達質粒（pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168）以DNA免疫方式誘導小鼠產生免疫應答的最適免疫劑量，為進一步研究pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168體內免疫學效應提供實驗數據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 真核表達質粒pcDNA3.1（+）系Invitrogen公司產品；質粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168和Ct E血清型由本實驗室構建或保存；限制性內切酶HindIII和XhoI均購自上海晶美公司；無內毒素質粒抽提純化試劑盒（Endofree Plasmid Maxi Kit）購自上海吉泰新繹生物技術有限公司（QIAGEN公司產品）；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA均購自聯科生物技術有限公司（KPL公司產品）；DL2 000TMDNA Marker和DL10 000TMDNA Marker均為TaKaRa公司產品；核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司產品）；Elx 800型全自動酶標分析儀（美國BioTek公司產品）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物 6～8周齡BALB/c雌性小鼠[SCXK（滬）2007-0005]，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，并飼養于溫州醫學院實驗動物中心SPF級飼養室。

1.3 pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的制備 質粒的構建方法參照文獻[5]。構建成功的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重組真核表達質粒，轉化大腸埃希菌DH5α菌株（Stratagene產品），利用無內毒素質粒抽提純化試劑盒抽提與純化，通過HindIII、XhoI雙酶切和PCR鑒定（擴增Ct MOMP168多表位特異性引物：上游引物為5’-GTCGACAAGCTTATGGGCGATAA TGAAAACCAGAG-3’，下游引物為5’-GTGGTGCTCGAG TTAGACTCCAATATATGG-3’），引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成。重組質粒鑒定正確后，于核酸蛋白檢測儀測定質粒濃度。

1.4 動物免疫 BALB/c雌性小鼠隨機分為4組，每組9只。根據文獻[6]設計三個免疫劑量組，即50、100和150μg劑量組，同時設PBS對照組。免疫前24 h小鼠腿部肌肉注射0.5%的利多卡因100μL松弛肌肉，鑒定正確的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重組質粒溶解于PBS緩沖液中，分別以上述3個免疫劑量于小鼠股四頭肌注射免疫，間隔2周，共免疫3次。PBS對照組注射同體積的PBS。于免疫后0、2、4、6、8周分別尾靜脈采血，分離血清-20 ℃凍存備用；并于免疫0、1、3、5、7周取小鼠陰道沖洗液，100～200μL/只，-20 ℃凍存備用。

1.5 間接ELISA法檢測小鼠血清特異性抗體IgG以本實驗室制備的原核表達Ct MOMP168多表位重組純化蛋白（制備方法參照文獻[5]）作為檢測抗原，用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）包被96孔酶標板，每孔包被檢測抗原100μL（50μg/mL），4 ℃過夜，PBS-Tween 20洗滌后，加入100μL PBSTween20-BSA（pH 7.4），37 ℃封閉2 h，洗滌后，每孔加入100μL各組小鼠血清（1:100稀釋），37℃ 1 h，洗滌后，每孔加入HRP-羊抗鼠IgG（1:2000稀釋）100μL，37 ℃ 1 h，洗滌后以鄰苯二胺（OPD）-H2O2室溫避光顯色15 min，加終止液（2 mol/L H2SO4）后，于酶標分析儀490 nm處讀取各孔A490值。

1.6 間接ELISA法檢測小鼠陰道沖洗液中特異性抗體sIgA 具體操作同上，以純化的原核表達Ct MOMP168多表位重組蛋白為檢測抗原，一抗為小鼠陰道沖洗液（100μL/孔），二抗為HRP-羊抗鼠IgA（1:2000稀釋），其余同上。

2 結果

2.1 質粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的抽提和鑒定 質粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168抽提純化鑒定后結果見圖1。重組質粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168（泳道2）較空質粒pcDNA3.1（+）對照（泳道1）有抬高，酶切出現168 bp目的片段和載體片段（泳道3），PCR擴增后同樣出現168 bp的目的條帶（泳道4），與預期目的基因片段大小一致，進一步測序后序列正確。核酸蛋白檢測儀測定質粒濃度為1.2 mg/mL。

圖1 質粒鑒定圖

2.2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測 不同免疫劑量組小鼠血清中針對Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測結果見圖2。3個不同免疫劑量組，血清中特異性抗體IgG生成量于免疫第4周后均開始隨免疫時間延長而逐步增加，3組不同免疫劑量組于4、6、8周抗體產生水平比較PBS對照組均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），其中150μg劑量組抗體IgG的產生優勢顯著，于4周（0.572±0.052）、6周（1.282±0.051）、8周（1.559±0.060)分別比較其他劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），顯示了質粒DNA免疫時抗體的產生具有明顯的劑量依賴關系。

圖2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測

2.3 免疫小鼠陰道分泌物中Ct MOMP168特異性抗體SIgA的檢測 不同免疫劑量組小鼠陰道分泌物中Ct MOMP168特異性分泌抗體SIgA的檢測結果見圖3。結果顯示，特異性抗體SIgA生成迅速，而且顯示出劑量依賴性。免疫開始后1周，150μg劑量組SIgA的生成比較PBS對照組，差異有統計學意義（P<0.05），而100、50μg劑量組比較PBS對照組差異均不具統計學意義（P>0.05）。150μg劑量組免疫后1周、3周比較其他劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），5周時SIgA的生成達到峰值，7周后各免疫劑量組SIgA均開始下降，但150μg劑量組SIgA生成仍高于其他劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），而50μg劑量組比較PBS對照組，差異無統計學意義（P>0.05）。

圖3 免疫小鼠陰道沖洗物中Ct MOMP168特異性抗體SIgA的檢測

3 討論

DNA免疫最大的優點就在于其進入體內后，疫苗抗原可以在靶細胞內以天然的方式被合成、加工并提呈給免疫系統，從而激發機體產生對疫苗基因產物特異性的CTL及抗體反應[7]。刺激機體免疫系統的方式與自然感染病原體的方式非常接近，這一特點對于構象型抗原表位引發保護性免疫尤為重要，因為目前重組技術在體外合成的蛋白質抗原常造成抗原表位的改變或丟失[8]。

由于Ct屬于胞內寄生菌，目前臨床上的治療方法很難有效徹底清除體內的病原體[9]。Th1型免疫反應被認為是清除Ct生殖道感染的主要機制，盡管血清抗體IgG、IgA、IgE等可提供一定的保護作用，且在Ct再次感染中發揮重要作用，但多數情況下無法阻止感染的擴散和疾病惡化[10]。近年來研究發現生殖道局部的分泌性抗體SlgA在防御和清除Ct感染中更具有明顯作用[11]，可阻斷Ct對黏膜上皮細胞的黏附，從而阻斷其對宿主細胞進一步的感染，還可通過抗體介導的調理作用增強巨噬細胞殺傷Ct的活性，或通過抗體依賴的細胞毒作用清除細胞內感染[12]。

本實驗設計了3個常用免疫劑量，從Ct特異性抗體IgG及分泌性抗體SIgA的動態發生過程來確定最有效的免疫劑量。結果顯示，3個不同免疫劑量組小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG產生水平均隨免疫時間延長而升高，其中150μg劑量組免疫開始第4周后，特異性抗體IgG生成量比較其他劑量組顯著升高。免疫小鼠陰道分泌物中SIgA的產生較快，免疫開始1周后150μg劑量組SIgA的生成水平顯著高于PBS對照組，且高于100μg劑量組。因此，pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168免疫后，小鼠特異性抗體IgG和陰道沖洗液中分泌性抗體sIgA的產生水平均表現出顯著的劑量依賴性，原因可能是高劑量免疫造成質粒吸收優勢。最終，本實驗為Ct MOMP168多表位重組真核表達質粒免疫小鼠確立了150μg的免疫劑量，為繼續研究Ct MOMP168多表位質粒載體疫苗的免疫保護效應提供了有效可行的免疫參考劑量。

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