環境污染物的生態毒理學研究方法進展

林枝，車寶光，王學東，張洪勤，王慧利

（溫州醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

環境污染物的生態毒理學研究方法進展

林枝，車寶光，王學東，張洪勤，王慧利

（溫州醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

生態毒理學；組學技術；生物標志物；進展；綜述文獻

隨著現代工業的迅速發展和農業現代化、集約化的不斷增加，污染物進入到生態系統中的數量和種類日益增加。如農藥、獸藥、飼料添加劑、抗生素等在環境中蓄積、遷移和降解而對整個生態系統產生廣泛而深遠的影響。現今新型污染物的種類不斷增加，如多環芳烴（PAH）、多溴聯苯醚（PBDEs）、全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）、酚類環境雌激素（PEE）等，都具有殘留期長、環境毒性大、不易降解等特點，致使在生態環境中長期積累成為持久性有機污染物（POPs），對周邊生物包括人的健康造成嚴重威脅。面對復雜污染物的環境隱患，環境工作者準確評價其生態風險的技術和方法也在不斷更新和完善。環境污染物的生態毒理學是20世紀70年代初期發展起來的一個毒理學分支，是生態學與毒理學之間相互滲透的一門邊緣學科。它主要研究環境污染物以及各種不良生態因子的暴露對生命系統產生的毒性效應，以及生命系統反饋解毒與適應進化機制及調控作用，其特征是將宏觀生態理論與微觀機制結合起來，到目前為止，在這方面的研究已積累了豐富經驗，取得了豐碩成果。現就污染物毒理學研究方法的進展作一綜述。

1 常規群體暴毒試驗(群體水平上的研究)

環境污染物在生態系統中經歷一系列復雜的理化和生物的變化，產生固有毒性、積累毒性、生物放大毒性和潛在毒性等，要正確評價其環境安全效應，最基本的方法就是對生物群體進行體內或體外的暴毒實驗，這種方法從宏觀角度、群體水平上，能更客觀直接地評價污染物的環境安全性和毒性效應。比如吳聲敢等[1]選擇啶蟲脒、丙溴磷、二嗪磷和馬拉硫磷4種殺蟲劑對斜生柵列藻、大型溞和斑馬魚3種水生生物進行急性毒性試驗。生物體在環境污染物的脅迫下，不管是藥物直接致毒還是代謝產物致毒，其毒理學終點都是對生物體的生長發育和繁殖的影響，及其致畸、致癌、致突變等現象的評判，量化的指標為致死率、生長抑制率及致畸率等。因此，常規群體暴毒試驗是毒理學研究的第一步，韓建等[2]研究PFOS/PFOA急性毒性實驗，表明PFOA是低毒性化合物，估計雄性和雌性大鼠的LD50分別為>500 mg/kg和250～500 mg/kg。

常規暴毒檢測方法（培養法、化學方法和實驗暴毒試驗）具有實驗簡單、較易控制，數據可重復性高、比較可靠，直接反映污染效應，耗費較低，其結果具有直接的生態相關性等優點，但其又具有滯后性、被動性、間接性、實際推廣價值有限等缺點，單獨的常規暴毒的量化標準已經不能滿足和適應新形勢下人們對環境污染研究精確性的要求，尤其是急性暴毒實驗結果不能評判一些持久性環境污染物的慢性環境效應。

2 生物標志物的研究

污染物對生物體的毒性效應必然是從作用于分子水平開始的，然后逐步在細胞、器官、個體、種群、群落、生態系統各個水平上反映出來。在分子毒理學研究中，許多研究者首先從生物化學方面探索能反映污染物對生物早期的影響參數，其中，生物標志物法因為測定指標全面、準確且系統，而得到了學者的公認。

美國科學院生物標志物委員會于1987年對生物標志物進行系統論述，將生物標志物定義為個體暴露于次生物質后發生的亞致死性生物化學變化[3]，這種變化的檢測結果可作為生物體暴露效應及易感性的指示物，可作為環境質量退化的早期警報，而且可以特異性地檢測到環境中致癌、致畸、致突變化合物的生物可利用性。

2.1 行為標志物（behavioral markers） 行為標志物的檢測可反映發生在細胞或分子水平上所產生的綜合效應。通常，隨著環境內某一種影響因子濃度或影響力的升高，對個體的影響最先發生變化的是生物的行為。其運動行為的變化不僅能反映環境污染物質對機體造成的代謝、神經和肌肉等組織或器官功能的毒性[4]，而且能改變生物個體的捕食、躲避敵害等生存能力，從而對生物個體乃至整個生物群落的健康與環境適應能力造成嚴重影響。

Johansson等[5]研究發現PFOS/PFOA具有神經毒性效應，表現為受試幼鼠的習慣性活動減少等。金美青等[6]通過多物種凈水監測儀監測斑馬魚在抗生素藥物和有機磷農藥暴露下的行為強度變化，發現斑馬魚對環境變化的行為反應快速且敏感，隨著藥物濃度的增加，斑馬魚行為強度的變化符合環境壓力模型。Viberg等[7]發現，哺乳動物圍生期暴露于PBDEs能導致幼體的行為異常，其中對運動和認知功能的損害尤為明顯；新生鼠單劑量經口暴露于不同的PBDEs同系物下，10 d后大多數動物出現自主行為紊亂，記憶力下降。Lilienthal等[8]研究表明，胚胎發育期暴露于四溴聯苯醚（BDE-47）、五溴聯苯醚（BDE-99）的小鼠出生后出現多動癥；暴露于BDE-99還會引起性激素水平及對甜食偏好的改變。He等[9]發現十溴聯苯醚（BDE-209）能導致斑馬魚仔魚的自由泳速度隨濃度升高而顯著下降。目前對PBDEs的研究多集中于神經行為、認知功能、學習與記憶等神經毒性效應方面，而對PBDEs如何引起神經毒性效應的機制研究較少涉及。

行為標志物檢測已采用計算機輔助生物測試系統，運動行為反應較傳統的急性毒性指標快速且敏感。因此，運動行為可以作為環境污染早期預警的生物在線監測指標。行為標志物檢測的另一大優點是對生物不產生損害。故污染物的行為學研究與生物信息學的有機結合得到發展。

2.2 生化標志物（biochemical markers） 生化標志物是生物體中最早可測得的污染物誘導反應，可為更高生物水平可能產生的損害提供信息。生化變化常涉及蛋白水平的變化、酶活性改變或DNA分子的變化等。污染物進入機體后，一方面在生物酶的催化作用下進行代謝轉化，另一方面也導致生物本身的酶活性改變。

在環境污染物的生態毒理學研究中細胞色素P450酶和谷胱甘肽轉移酶（GST）作為外源物質的主要代謝酶被視為指示環境污染物毒性效應的重要生化標志物。有研究結果表明，魚類、貝類的P450對環境誘導的反應具有敏感性，并且有很好的劑量-效應關系。Ferrari等[10]研究發現，鮭魚暴露于西維因后，GST活性受到抑制。Aijun等[11]采用實驗室模擬條件，研究了不同劑量的BDE-209在不同時間段對鯽魚肝臟氧化脅迫指標的影響，并對BDE-209致魚肝臟氧化損傷的毒性機制進行了探討。

抗氧化防御系統是生物體內重要的活性氧清除系統，過氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）共同組成了生物體內活性氧防御系統，因此，成分的改變也可作為機體遭受氧化脅迫的早期預警生物標志物。例如，周科[12]用不同濃度BDE-47的污染沉積物暴露后，銅銹環棱螺肝胰臟的SOD和CAT活性表現出較為明顯的濃度或時間依賴性效應關系。Jing等[13]將珍珠牡蠣暴露于含Pb的溶液中，經不同時間段暴露之后分析其酶活性。結果表明經Pb暴露之后牡蠣外套膜的SOD活性就被顯著地誘導，隨著暴露時間的延長，SOD活性誘導率漸趨下降。

許多環境毒物如PAH、芳胺、亞硝胺、霉菌毒素和農藥參與形成DNA加合物，對DNA的結構和穩定性產生影響，導致DNA分子的各種損傷，包括DNA鏈的斷裂、交聯、烷化DNA加合物、PAH-DNA加合物、環化加合物等的形成。彗星實驗是近年發展起來的一種快速檢測哺乳動物細胞DNA損傷的實驗方法。Geng等[14]用此方法通過敵敵畏、丁草胺對斑腿泛樹蠟蚌紅細胞DNA的損傷研究發現，DNA損傷程度隨著處理組濃度的增加而增加。Marczynski等[15]研究發現工作場所空氣中苯或萘濃度的增加可引起接觸工人的白細胞的DNA斷線率的增加。Bagchi等[16]證實萘可以誘使活性氧自由基增加,導致脂質的過氧化反應和DNA的破壞。從文獻可以看出，PAH-DNA加合物是一種有效的生物標志物，與環境暴露PAH有著密切的關系。

應激蛋白又稱熱休克蛋白（HSP），包括HSP家族及分子伴侶，是細胞保護機制的重要部分。近年來，很多研究用其作為環境效應的生物標志物。脊椎動物金屬硫蛋白（MTs）的合成可被金屬、有機化合物或其他應激因素誘導，其濃度不僅可反映急性毒性、污染物長期作用的動態過程和累積情況，還可反映該動物對污染物脅迫的解毒機制與解毒容量。跳蟲分子生物標志物引起人們的重視，尤其集中于對跳蟲體內金屬硫蛋白和應激蛋白的研究。例如，有研究發現跳蟲的應激蛋白可被殺蟲劑地樂酚顯著誘導[17]。

傳統毒理學的毒性測試研究使用的動物多、實驗周期長、工作量大，表型改變、形態學指標等較為復雜，并不能揭示污染物對生物體的損害作用以及提供預警信息。所以需要一個綜合的、全面性和準確性的環境監測體系來高效、準確地對污染物的生態效應進行評估，而生物標志物檢測特別是在分子水平上（DNA、RNA、離子通道和酶活性等）的變化，為揭示和預測污染物對個體的早期影響和對群體以至整個生態系統的影響提供了重要信息。

3 免疫組織化學研究

免疫組織化學或稱免疫細胞化學，是指利用抗原與抗體特異性結合的原理，借助于光學、熒光或電子顯微鏡觀察其性質定位，還可以利用細胞分光光度計、圖像分析儀、共聚焦顯微鏡等進行細胞原位定量測定，來檢查細胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法。通過把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙結合起來，在微觀上原位地確定組織結構的化學成分乃至基因表達。由于其原位性、直觀性和特異性的優點，被迅速擴展應用于污染物毒理學的研究上。朱愛華等[17]對洛克沙胂暴露下斑馬魚組織（鰓、肝臟、性腺）中HSP70的表達定位進行了免疫組織化學初步研究，發現HSP70在斑馬魚的鰓、肝臟、性腺3種組織中有特異性表達。Han等[18]發現將斑馬魚暴露于硫丹下，在200 ng/L的處理組中雄性的肝臟指數（HSI）明顯上升，雌性的性腺指數（GSI）明顯下降；10 ng/L的處理組中雄性的HSI平均值最低，而其GSI卻最高。Zha等[19]用16 ng/L的17-β-乙炔基雌二醇（EE2）處理中國鰷魚，觀察到雌性中的GSI發生類似變化。黃莉等[20]運用免疫組化的方法觀察小鼠妊娠子宮對四氯苯并-P-二惡英（TCDD）毒性的敏感性，發現低劑量TCDD暴露下出現的強烈生殖毒性與TCDD在小鼠子宮內的蓄積和小鼠子宮內膜細胞中細胞色素P4501A1的誘導能力有關。在運用酵母基因系統進行不同小鼠組織中TCDD含量檢測時發現，脂肪中TCDD蓄積量最多，其次是肝臟、子宮和胎兒。

免疫組織化學技術具有特異性強、靈敏度高、定位準確和簡便快速等優點，這是較之于其他化學方法不可替代的優越性，又能夠有機地同形態、功能及代謝的研究結合起來，用以研究其他技術（如化學、生化、免疫和生理等）難以深入的領域。

4 組學技術在系統毒理學研究中的應用

近年來興起的功能基因組學，為環境污染物的生態毒理學的研究提供了良好的契機。組學研究不僅可能發現一些與該類藥物污染相關的差異表達的新基因、新蛋白，而且可對整個轉錄的基因進行高度動態的時空監測。其中代謝組學方法則可為污染因子脅迫下生物體代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關性，能系統地掌握污染物的分子致毒機制。

4.1 蛋白質組學（proteomics） 當從mRNA水平考慮和對單個蛋白質進行研究已無法滿足后基因組時代的要求時，蛋白質組學應運而生。它以直接參與生命活動的蛋白質為研究目標，界定表達蛋白質過程中涉及的影響因素，已廣泛融入環境科學、生態毒理學等領域。

毒理蛋白質組學是在整體的蛋白質水平上，探討生物接觸不同毒物或環境脅迫下，細胞蛋白質的存在及其活動方式（蛋白質譜）的變化，在更加貼近生命本質的層次上探討和闡明有毒污染物及其濃度變化所致蛋白質譜改變的“指紋特征”，也可作為有效表征污染物暴露的生物標志物。

近幾年，從毒理蛋白質組學角度分析污染物脅迫下生物基因表達與調控的變化成為研究熱點。Silvestre等[21]應用蛋白質組學技術研究了鎘對中華絨螯蟹的急慢性毒性，發現鎘急性中毒時，A-微管蛋白、GST以及甲殼類鈣結合蛋白等的表達下調，GST異形體表達上調。鎘慢性中毒時，GST及組織蛋白D等均過量表達，ATP合成酶B和A-微管蛋白等表達下調。Shrader等[22]研究了斑馬魚胚胎暴露于雌二醇、壬基酚及不同濃度的內分泌干擾物時蛋白質譜的變化，通過蛋白質譜的差異表達說明這兩種化合物的反應路徑不同，致毒機制不同，作用的毒理學終點不同。徐立利等[23]結合蛋白質組學分析方法和軟件，構建斑馬魚胚胎的蛋白質表達譜，分析表明在250 ppm濃度的毒死蜱脅迫下，24 hpf斑馬魚胚胎就產生19個差異蛋白質。Villeneuve等[24]利用蛋白質組學建立硬骨魚類下丘腦-垂體-性腺軸的毒理模型，包含魚類繁殖相關的6個主要器官，涉及調控軸上105個蛋白和40個小分子的相互作用，25個基因的轉錄調控。

但是，總體而言毒理蛋白質組學尚處于發展階段，研究范圍還非常有限，未來毒理蛋白質組學的發展不僅需要高通量、高靈敏度、自動化的蛋白質組學技術作技術支撐，更需要通過設計合理的實驗方案、采用正確的統計學方法，使實驗室內與室外的實驗結果具有可比性，達到實驗效益的最大化。

4.2 轉錄組學（transcriptomics） 實際上，污染物的毒性效應和生物應答無疑是基因表達調控協同運作的反應信號，即使我們對每個生物標志物的功能都已確定，有關致毒機制問題也不能得到很好的解答。采用新一代高通量RNA-seq測序技術并借助于生物信息學分析軟件，對染毒和對照生物品系進行轉錄組和轉錄后調控差異分析，尋找隱藏在基因組內microRNA的調控網絡是實現系統毒理學研究的關鍵，也是比較不同物種對環境污染敏感的多樣性、解毒代謝途徑多樣性的重要手段。Linney等[25]將斑馬魚胚胎暴露于毒死蜱，利用基因芯片技術研究發現，45個基因明顯上調表達，15個基因下調表達。

最近才發展起來的轉錄組調控網絡的研究成為人們深入毒理分子機制的最有效手段，也是生物領域嶄新的研究熱點。microRNA 是全基因組基因表達調控網絡中的一部分，它隱藏于基因組內的信息層，有學者稱之為基因組內的“暗物質”，不可見卻執行著新層次調控基因表達的功能。目前只有很少部分microRNA功能通過實驗確定與環境脅迫應答有關，這為以全microRNA表達圖譜來進行毒理分析，即毒理microRNA基因組學提供了理論依據[26]。目前，利用microRNA毒理基因組學進行毒理學分析的研究寥寥可數，而且大部分局限于單個microRNA的功能分析，還沒有人從全microRNA表達譜的角度來進行研究。不過可以肯定的是，一些毒性相關的基因（如P450、p53等）的表達調控與microRNA相關[27]。

4.3 代謝組學（metabolomics） 轉錄組學可對整個轉錄的基因進行高度動態的時空監測，而代謝組學方法則可為污染因子脅迫下生物體代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關性。通過代謝物化學分析技術及數據分析技術綜合運用使得代謝組研究在疾病診斷、藥理研究以及毒理學等研究中發揮了極為重要的作用。

比較分析健康狀態與疾病狀態下小分子代謝物表達的差異，這有助于人們尋找各種疾病早期診斷的生物標志物，可用于疾病預后及治療效果的評判。而在毒理學研究中，利用代謝組技術分析代謝物組分的變化可直接反映毒物脅迫對機體造成的最終影響。比如Lelliott等[28]利用磁共振與轉錄組技術有機結合，研究表明三苯氧胺（TMX）作用通過降低脂肪酸合成酶（FAS）的表達及活性嚴重影響了肝臟內脂肪代謝。梁宇杰[29]通過磁共振，統計大鼠尿液和血清的生化代謝產物譜，發現殘殺威、氯菊酷及等毒性混配劑的亞慢性染毒會引起一定程度的肝毒性和腎毒性。Williams等[30]利用高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）研究D-絲氨酸給藥大鼠的尿液，發現色氨酸濃度升高而其代謝物含量下降，得出絲氨酸毒性損傷與抑制色氨酸分解代謝有關，同時給予一定劑量安息香酸鈉鹽能抑制D-絲氨酸引起尿液代謝功能的紊亂。

與其他毒理學研究方法一樣，代謝組學技術并不能解決所有問題，但能為生物學多個領域的研究提供有用信息。比如，將蛋白質組學數據與代謝組學數據進行整合，生物代謝的終點有助于驗證基于蛋白質組學研究提出的假設。代謝組學研究使得代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關性，極大促進了后基因組學時代功能基因組研究的發展。

5 展望

當前，生態風險評價研究正朝著多重性和實際性的方向發展。在現階段的研究中，還存在問題如下：①毒理學研究的污染物設置濃度與環境中實際殘存濃度相差甚遠，室內高濃度的致毒效應往往不能正確評估污染物的生態風險。實際上，環境中尤其是城市污水處理廠處理末端的痕量污染物正是環境污染的主要源頭，經過污水處理廠排水后造成二次污染。雖然這些痕量的漏檢物不會對生物帶來直接而快速的影響，但其長期作用于生態系統可引發慢性致毒效應，恰恰對水生生物和人類健康產生隱患，也是人們最易忽視的部分，因此應加強污染物的慢性致毒機制研究，或尋找更敏感的標志物，作為野外真實環境的早期診斷及生態風險評價的指標。②多數情況下，單一化合物在環境中痕量存在使人們忽視其可能的環境效應，然而，多種藥物在環境中同時存在則意味著加和或協同作用的可能性，但是在相對穩定的生境下，多種藥物痕量水平的復合污染慢性毒理學效應的研究報道還較少。實際上，生態系統中往往是結構不同、作用模式不同的污染物以復合狀態共同存在，依靠單一的污染物研究不足以提供全面的風險信息，要準確真實地評價其環境風險，展開不同作用模式的新型污染物痕量濃度的聯合毒性效應研究，建立生態毒理學模型體系成為當務之急。③環境內多重途徑的多種化合物的聯合作用是一個具挑戰性且有很強現實意義的課題。其聯合作用會隨混合物各組分組成、暴露時間、途徑、次序等不同而改變，在活體實驗中，化合物在生物體內的代謝轉化更使研究復雜化。因此，有關環境污染物聯合暴露的研究一般集中在離體（in vitro）細胞試驗上，而對于動物的活體（in vivo）試驗，鑒于實驗操作和結果解析上的困難，研究較少。

利用微觀與宏觀方法相結合來評價有毒污染物的毒性將是重要的研究趨勢：分子、細胞、個體、種群、群落直至整個生態系統是一個有機聯系的整體，在不同結構和功能層次上闡述污染效應對生態毒理學的環境解釋能力是不同的。從細胞到分子水平是毒理學微觀技術發展的必然趨勢，但僅從基因和蛋白質水平上研究外源性化學物的毒性及其機制是不夠的。只有通過將細胞、分子水平的研究與整體、種群等各個不同層次的研究結合起來才能正確評價污染物的毒性效應。

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Q3

C

1000-2138（2012）02-0192-05

2011-11-07

浙江省自然科學基金資助項目（5100333）；浙江省科技廳公益項目（2011C23114）。

林枝（1990-），女，浙江臺州人，本科生。

王慧利，博士，副教授，Email：whuili@163.com。

吳健敏）

·高教研究·