ω-芋螺毒素研究進(jìn)展

左艷敏王筱婧王東興錢秋玉程遠(yuǎn)國

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院263臨床部藥劑科，101149；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所藥物研究室，100071)

芋螺毒素(Conotoxins)是自海洋腹足綱軟體動(dòng)物芋螺(Conus)中得到的一類具有生物活性的肽類毒素[1]。我國約有近百余種芋螺分布，集中在南海、北部灣和臺(tái)灣海域，其中每種芋螺的毒液中均含有百余種不同的活性多肽即芋螺毒素，且不同種的芋螺所含的芋螺毒素也各不相同，因此至少存在5萬多種芋螺毒素。芋螺毒素可引起動(dòng)物出現(xiàn)驚厥、顫抖甚至麻痹死亡。迄今為止，已經(jīng)分離鑒定了百余種芋螺毒素[2-5]。

芋螺毒素一般是含有7～46個(gè)氨基酸殘基的小肽，分子量小，富含二硫鍵，前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有多樣性，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的核酸編碼的動(dòng)物神經(jīng)毒素肽。芋螺毒素能選擇性地作用于離子通道等蛋白受體，進(jìn)而影響神經(jīng)傳導(dǎo)，產(chǎn)生不同的生理作用[6]。根據(jù)芋螺毒素基因及其前體蛋白信號(hào)肽的保守性，可將其分為A、O、T、M、P、I等多個(gè)超家族，在每個(gè)超家族中，再依據(jù)其對(duì)生物體作用靶位以及藥理活性的不同又可將其分為α、ω、μ、δ等不同的亞型。α、αA、κA屬于A-超家族，ω、δ、κ、μO屬于O-超家族，μ、φ、κM屬于M-超家族。

O-超家族芋螺毒素主要作用于電壓門控離子通道(又稱電壓敏感性通道)，包括Ca2+通道、Na+通道和K+通道等。作用于Ca2+通道的只有O-超家族的ω-芋螺毒素。由于ω-芋螺毒素具有高親和力、高度專一性的特點(diǎn)，能特異性地阻斷電壓敏感型Ca2+通道，在離子通道亞型鑒定、神經(jīng)疾病治療方面發(fā)揮重要作用，已成為神經(jīng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、多肽化學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6-12]。下面就其藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展以及合成方法兩方面進(jìn)行闡述。

1 ω-芋螺毒素的藥代動(dòng)力學(xué)研究

目前對(duì)ω-芋螺毒素的藥代動(dòng)力學(xué)研究主要集中于其已上市的合成等效物Ziconotide。Ziconotide是首個(gè)應(yīng)用于臨床的具有神經(jīng)元特異性的N-型電壓敏感性鈣通道阻斷劑，已分別獲得美國FDA和歐盟EC的上市許可。其作用機(jī)制是通過鞘內(nèi)輸注治療嚴(yán)重慢性疼痛，可緩解其他治療無效的疼痛，并且長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用該藥不會(huì)產(chǎn)生成癮性及耐受性。

1.1 臨床前藥動(dòng)學(xué)研究 Bowersox等人[13]對(duì)Ziconotide 24 h持續(xù)、勻速靜脈輸注時(shí)在大鼠及獼猴體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行了研究。采用放免法對(duì)不同時(shí)間的血漿藥物濃度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示兩種動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)很相近，且各項(xiàng)參數(shù)無劑量及性別依賴性；開始滴注后的2～4 h內(nèi)，到達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度(Css)，且所得數(shù)據(jù)符合二室模型；穩(wěn)態(tài)時(shí)的分布體積(Vd)約為體質(zhì)量的40%，表明藥物在血管內(nèi)外均有分布，血管外藥物分布于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的體液中；大鼠和獼猴的血漿蛋白結(jié)合率分別為56%和73%，且呈非特異性、非飽和性和低親和力，因此藥物不會(huì)在血管內(nèi)滯留。其清除過程由兩階段組成，消除曲線為雙指數(shù)曲線。大鼠和獼猴的表觀清除半衰期分別為4.61 h和6.48 h。大鼠在滴注開始1 h內(nèi)，高低劑量組分別約有93%和17%出現(xiàn)輕微震顫；獼猴在滴注開始0.5 h內(nèi)，所有高劑量組和50%低劑量組出現(xiàn)輕微震顫。

在Elan公司關(guān)于犬的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)告[14]中，單次鞘內(nèi)注射Ziconotide后，其在犬的腦脊液中快速分布，進(jìn)而迅速分布至脊髓及其他組織。持續(xù)鞘內(nèi)滴注Ziconotide后，在腦脊液中的藥物濃度與在血漿中的藥物濃度之比約為1 000∶1，表明其主要分布于作用靶點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中結(jié)合H3-inulin，結(jié)果顯示Ziconotide在腦脊液中的清除速度與腦脊液本身的總體流動(dòng)速度接近。

Staats等人[15]的研究表明，鞘內(nèi)注射的Ziconotide在血漿中消除迅速，因此導(dǎo)致相當(dāng)少的血漿蛋白結(jié)合。靜脈注射的Ziconotide于2～24 h即在大鼠的腦組織中降解，并且檢測(cè)不到所產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，其從腦脊液和循環(huán)系統(tǒng)中清除的速度也較快，表明Ziconotide在腦脊液中的分布和代謝也是迅速的。

Newcomb等人[16]研究了Ziconotide的腦內(nèi)生物利用度、血-腦通透性及其在腦細(xì)胞外液的擴(kuò)散、降解情況。靜脈注射Ziconotide后，約3～20 min，在大鼠腦內(nèi)的濃度達(dá)到最大值，每克組織中的藥物濃度約為0.003%～0.006%，2 h后降至每克組織中含0.001%。在海馬植入體內(nèi)使用透析探針灌注Ziconotide時(shí)，也有相似的結(jié)果。圖像分析和連續(xù)切片法均顯示在透析探針周圍細(xì)胞外液中Ziconotide的含量很少，2 h后其范圍也在1 mm以內(nèi)。

1.2 臨床藥動(dòng)學(xué)研究 健康男性志愿者靜脈持續(xù)滴注本品的血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)表明，該藥物符合線性消除的二房室開放性藥動(dòng)學(xué)模型。血漿穩(wěn)態(tài)濃度與滴注速率成比例。消除半衰期為1.3 h，t1/2約為5.3 h[17]。

Wermeling[14]和Staats等人[15]還研究了Ziconotide在腦脊液中的藥動(dòng)學(xué)(PK)，以及其在血漿和腦脊液中的濃度與安全性和有效性的關(guān)系(PK-PD關(guān)系)。鞘內(nèi)注射Ziconotide(1、5、7.5或10 μg·kg-1·d-1)于22名慢性非惡性疼痛患者后48 h內(nèi)，腦脊液中的藥物濃度曲線可能呈多房室特征；腦脊液中藥物半衰期為2.9～6.5 h(平均為4.5 h)，清除率為0.26 mL·min-1，分布容積為99.2 mL。劑量標(biāo)準(zhǔn)化AUC、Cmax，Cl，Vd和t1/2等均與劑量成比例，提示其在腦脊液的分布不隨劑量增加而出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。腦脊液的平均值和中間值分別是155 mL和99 mL，均與成人的腦脊液體積約(130±30)mL接近。腦脊液的AUC/D平均值是70.8 ng·h·mL-1·μg-1，t1/2是4.6 h，Cmax/D是15.0 ng·mL-1·μg-1。腦脊液與血漿中的藥物濃度比是303∶1 165。PK-PD有相關(guān)性。采用疼痛強(qiáng)度視覺模擬評(píng)分及疼痛緩解分類評(píng)分觀察到鎮(zhèn)痛效果與劑量相關(guān)，但大劑量在增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效果的同時(shí)也增加了神經(jīng)系統(tǒng)副作用發(fā)生的可能。4例病人給藥后出現(xiàn)低血壓。

Ziconotide在血漿和腦脊液中呈線性清除過程[17]，與其以1～10μg·kg-1·d-1靜脈滴注時(shí)血漿中的特征一致[18]。腦脊液Cl的平均值和中間值分別是0.38 mL·min-1和0.26 mL·min-1。成人腦脊液形成或消除的速度是0.35～0.37mL·min-1，即其在腦脊液中的清除速度與腦脊液本身的總體流動(dòng)或稱周轉(zhuǎn)率接近[15]，這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相吻合。

2 ω-芋螺毒素的合成

目前解決藥源問題主要有三種方法。

第一種是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法獲取量非常少，且近年來海洋生態(tài)的破壞使得野生芋螺數(shù)量急劇減少，該法會(huì)進(jìn)一步加劇芋螺資源惡化，因此靠分離提取獲得大量的ω-芋螺毒素用于研究和生產(chǎn)并不現(xiàn)實(shí)，但提取到的少量天然毒液可通過一系列儀器分析手段得到單個(gè)毒素肽的氨基酸序列，再根據(jù)所得序列人工合成這些肽，可進(jìn)一步用于活性測(cè)試和結(jié)構(gòu)分析。

第二種是基因工程方法，即將芋螺毒素的基因轉(zhuǎn)化到微生物中使其表達(dá)，后期再進(jìn)行分離純化[19]。由于部分ω-芋螺毒素的N端為Cys，酰胺化C端，加之原核表達(dá)系統(tǒng)無法加工去除N-端信號(hào)肽序列，無法解決酰胺化C端問題，且ω-芋螺毒素分子小，堿性氨基酸較多，難于形成特定活性構(gòu)象，使得分離純化較為困難。但隨著基因工程技術(shù)的日新月異，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信號(hào)肽，或同時(shí)轉(zhuǎn)入酰胺化酶基因，可望在不久的將來生產(chǎn)出大量廉價(jià)的重組芋螺毒素，這對(duì)芋螺毒素藥物研究和產(chǎn)業(yè)化將起到至關(guān)重要的作用。另一方面，芋螺毒素是基因直接表達(dá)的產(chǎn)物，現(xiàn)代基因工程技術(shù)也促進(jìn)了芋螺毒素的研究與開發(fā)。目前國內(nèi)外對(duì)芋螺毒素的研究已深入到了分子生物學(xué)領(lǐng)域，在研究芋螺毒素基因的結(jié)構(gòu)和生物合成過程，尋找新芋螺毒素基因，研究其分子遺傳學(xué)機(jī)制，蛋白質(zhì)折疊機(jī)制方面有重要的應(yīng)用，且已取得了較快的進(jìn)展。構(gòu)建芋螺毒素cDNA文庫，從中篩選新ω-芋螺毒素基因已成為研究新ω-芋螺毒素及其分子特征的重要途徑之一[20]。

第三種是采用人工化學(xué)合成的方法，即通過分離天然芋螺毒素后測(cè)序或采用基因克隆方式獲得芋螺毒素序列，然后采用人工化學(xué)合成獲得更多量的芋螺毒素，目前較多使用的是多肽固相合成法。與傳統(tǒng)的多肽液相合成法相比，該法具有如下優(yōu)越性：只需經(jīng)過過濾和沖洗，就可以將產(chǎn)物多肽從可溶性試劑中分離開來；易于使用自動(dòng)化設(shè)備；過量的反應(yīng)試劑促使反應(yīng)徹底進(jìn)行；反應(yīng)產(chǎn)物多肽一直結(jié)合在固相載體上，損失量將達(dá)到最小。根據(jù)氨基端保護(hù)基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法為Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少等特點(diǎn)，大多芋螺毒素的合成都采用該方法[21-24]。合成后將肽鏈從樹脂上裂解下來，常用的裂解劑為reagent K試劑(trifluoroacetic acid∶water∶ ethanedithiol∶ phenol∶thioanisole，90∶5∶ 2.5∶7.5∶5)。接著脫去側(cè)鏈保護(hù)基、復(fù)性、純化，即可得到與天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究[25-26]。但由于ω-芋螺毒素氨基酸殘基較多，一般都在25個(gè)以上，其人工合成的產(chǎn)率較小，純度也低，合成的肽還需氧化折疊才能形成正確的構(gòu)象。氧化折疊的方法有空 氣 氧 化 法 、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧 化 法 等 。Favreau等[27]在合成ω-CNVIIA時(shí)，對(duì)這幾種氧化折疊方法作了比較，發(fā)現(xiàn)gluthatione氧化法效果最好。隨后進(jìn)行純化，即可得到具有天然毒素活性且純度較高的多肽，最后利用NMR技術(shù)進(jìn)行構(gòu)象分析[28-29]。因此，人工合成ω-芋螺毒素的成本較高，還不能完全滿足作為藥物商業(yè)化生產(chǎn)的要求。但由于ω-芋螺毒素藥物的用量小，效果好，價(jià)值高，人工合成可部分滿足市場(chǎng)需求。

綜上所述，ω-芋螺毒素具有分子小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易化學(xué)合成等特點(diǎn)，是一個(gè)闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的微型模型。海洋中有豐富的芋螺資源，為人類提供了良好的資源信息庫。目前得到的ω-芋螺毒素大多來源于食魚芋螺，但食蟲芋螺和食螺芋螺當(dāng)中也存在豐富的ω-芋螺毒素。國外已對(duì)30多種芋螺進(jìn)行了研究，由于芋螺所處的地理環(huán)境不同，同一芋螺所產(chǎn)生的芋螺毒素可能會(huì)完全不同。國內(nèi)主要對(duì)幾種芋螺(淺紋芋螺、織錦芋螺和桶形芋螺)毒素基因和毒液成分進(jìn)行了研究，絕大多數(shù)海南產(chǎn)的芋螺毒素急待研究與開發(fā)。雖然ω-芋螺毒素研究已經(jīng)在生化、分子生物學(xué)、電生理和藥理等方面取得了重要進(jìn)展，但其深度和廣度還十分不夠，有待于進(jìn)一步研究，為芋螺資源的開發(fā)利用提供更多理論依據(jù)。

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