腫瘤干細胞蛋白質組學的研究進展

閔凌峰 徐興祥 宋 勇

惡性腫瘤是嚴重危及人類生命健康的疾病，其病死率呈逐年上升的趨勢［1］。我國惡性腫瘤死亡率處于世界較高水平，且隨著生態環境、生活方式的改變而呈現持續性上升勢頭［2］。目前，對于多數惡性腫瘤可以采用手術、放化療及生物免疫治療等方法，但卻無法從根本上治愈腫瘤。腫瘤干細胞概念的提出為治愈腫瘤提供了一線希望，也使得近些年來腫瘤干細胞領域的研究進入了高速增長期［3］。蛋白質組學(proteomics)是研究細胞內全部蛋白質的組成及其規律的學科，即指某一物種、個體、器官、組織或者細胞基因組的全部蛋白質產物的表達譜［4］。在過去的幾十年中，蛋白質組學技術已在腫瘤研究中取得了豐碩的成果，這些研究反映在腫瘤的發生機制、轉移及耐藥的分子機制、以及預后和治療反應的生物標志物等方面［5］。目前，將蛋白質組學技術應用到腫瘤干細胞研究中的報道還很少。現就腫瘤干細胞蛋白組學方面的研究進展進行綜述。

一、腫瘤干細胞的概念與特性

美國癌癥研究協會的干細胞研討會(The American Association for Cancer Research Stem Cell Workshop)對于腫瘤干細胞的定義為:腫瘤組織中存在一小部分具有干細胞性質的腫瘤干細胞，具有無限的自我更新能力，可以產生與上一代完全相同的子代細胞，并且具有多種分化潛能和高度增殖能力，可形成由異質性腫瘤細胞組成的腫瘤組織［6］。雖然腫瘤干細胞在腫瘤組織中的含量較少，在大部分病例中少于1%，但是其對腫瘤患者的預后有著重要的影響。

從功能的角度來看，腫瘤干細胞具有很多與正常干細胞相似的特性，包括:①具有相似的表面標志物及信號傳導通路:如CD147、CD133、CD44、Sox2、ABCG2/BCRP1等表面標志物，存在相似的生長調控機制，如Notch、Wnt和Shh等信號通路［7-8］;②多處于細胞周期的靜息期或休眠期，即長期處于細胞生長周期的G0期;③均具有自我更新和分裂增殖能力;④都具有多向分化的潛能;⑤均具有高表達的ABC轉運蛋白水平及DNA修復水平，連同他們的低增殖指數，使這些細胞對放化療均不敏感。但腫瘤干細胞又具有一些與正常干細胞不同的特性:①正常干細胞具有自我穩定調控能力不會無限制生長，而腫瘤干細胞缺乏自穩能力;②腫瘤干細胞缺乏分化成熟的能力，缺乏自我更新信號轉導途徑的負反饋調節機制;③腫瘤干細胞傾向于累積復制的錯誤，而正常成體干細胞能夠防止復制錯誤的發展;④腫瘤干細胞對染料Hoechst 33342拒染［9］。

二、腫瘤干細胞蛋白質組學研究的意義

目前腫瘤干細胞研究中熱點領域主要集中在以下幾個方面，第一是腫瘤干細胞形成的分子機制上。目前在腫瘤形成的機制上主流有兩派學說，一派為“基因突變”學說，他們認為腫瘤是正常細胞中基因突變不斷累積，最后形成的腫瘤細胞;另一派就是“腫瘤干細胞形成”學說，認為先由正常干細胞或其他細胞形成腫瘤干細胞，再由腫瘤干細胞逐步分化出腫瘤細胞。但是，目前腫瘤干細胞形成的分子機制還不清楚，有研究發現干細胞兩個重要的調節基因WNT-1基因及WIF-1與肺癌的發生發展有著重要的聯系。但正常干細胞是如何形成腫瘤干細胞的，在這個過程中，那些基因的表達受到了調控，起到了怎樣的作用，這些都不清楚。因此，檢測腫瘤干細胞與正常細胞及正常干細胞之間的差異表達基因具有很重要作用，主要是檢測核蛋白表達的差異。第二是對腫瘤干細胞特異性的標志物的研究，目前關于腫瘤干細胞的研究大多采用的是正常干細胞中常見的CD133或CD44等表面標志物，尚缺乏得到廣泛認可的腫瘤干細胞表面標志物。第三是對腫瘤干細胞特異性藥物靶點的篩選，篩選類似于EGFR的特異性靶點，也就是找到腫瘤干細胞與其他細胞表達不同的膜蛋白或者核蛋白。由此可見，目前腫瘤干細胞研究的關鍵問題就是要篩選到肺癌干細胞差異性表達的基因。目前篩選差異表達基因的常用技術方法有兩個，一個是在基因水平的Microarray技術，另一個是在蛋白水平的蛋白組學技術。雖然Microarray技術可以揭示干細胞及腫瘤干細胞特定基因的表達譜，但卻無法提供關于翻譯后調控及蛋白質相互作用方面的信息［10］。而且，細胞內蛋白質表達水平的變化也不總是與mRNA水平的變化相對應［11］。因此，蛋白質組學分析被認為是研究腫瘤干細胞潛在藥物靶點的重要途徑［12］。

三、腫瘤干細胞蛋白質組學常用技術方法

蛋白質分離技術、生物質譜技術及生物信息學技術對腫瘤干細胞蛋白質組學的研究發展有決定性的影響，目前，常用的腫瘤干細胞蛋白質組學技術如下。

1．蛋白分離技術:雙向凝膠電泳技術(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)。該技術主要用于分離細胞或組織蛋白質抽提物，構建特定組織或細胞蛋白質的“二維電泳圖譜”，分析蛋白質的表達狀況，進行差異比較。2DE技術憑借其高通量、高靈敏度、高分辨率和重復性好，便于計算機進行圖像分析處理，可以很好地與質譜分析等鑒定方法匹配的優點，已成為目前蛋白質組學研究中最常用的蛋白質分離技術。其他的蛋白質分離技術有液相色譜和毛細管電泳技術。尤其是新近發展的液相色譜技術可與質譜聯用，具有高分辨率、可直接用于高復雜性蛋白質混合物的分析，對低豐度蛋白的檢測能力超過了2DE［13］。

2．生物質譜技術:蛋白質組學研究中常用的質譜技術有:①基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術;②電噴霧串聯質譜(ESI-MS/MS)技術;③表面增強激光解析離子化一飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術等。近來質譜技術與液相色譜聯用(liquid chromatography/tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)有了較大發展，使其具有高敏感性和分辨率，檢測范圍較大等特點［14］。

3．生物信息學技術:生物信息學技術在蛋白質組研究中具有重要作用:①構建和分析雙向凝膠電泳圖譜;②數據庫的搜索與構建;③目標蛋白的鎖定。在得到大量的差異表達蛋白后，需要通過生物信息學技術對差異表達蛋白進行基因注釋、比較基因組學、代謝網絡分析、基因表達譜網絡分析、蛋白質結構與功能分析以及藥物靶點篩選等研究，為進一步的研究打下基礎［15］。

四、腫瘤干細胞蛋白質組學研究進展

蛋白質組學研究現已在多種人類腫瘤組織或細胞系如肝癌、乳腺癌、結腸癌等癌癥中開展，并已取得了一些成果，見表1。

表1 關于腫瘤干細胞蛋白質組學的總結列表Table 1 Summary of proteomics of cancer stem cells

1．造血系統腫瘤:腫瘤干細胞蛋白組學研究最早應用于造血系統腫瘤干細胞的研究。Ota等［22］通過表面標記物AC133從13個白血病患者的骨髓造血干細胞中分離出AC133(+)的腫瘤干細胞，利用雙向電泳蛋白圖譜，檢測到11差異表達的蛋白點，利用質譜技術鑒定出10個差異表達蛋白，這些蛋白的功能涉及細胞周期調控、損傷修復、氧化還原反應的調節，包括NUMA(與有絲分裂器有關的核蛋白)、熱休克蛋白(包括 HSPA5、HSPA8(p71)、HSPA8(p34)、HSPA9B)、ADA、ALDOA、TPI1、GST-pi、SOD2、PPIA。這些差異表達的基因為研究人類白血病的發病機制提供了很好的線索。

2．消化系統腫瘤:目前，蛋白質組學技術在消化系統腫瘤干細胞研究中的應用最多，涉及了結腸癌、肝癌、結腸癌肝轉移，既包括有在細胞系基礎上的研究，也有分離實體瘤腫瘤干細胞的研究。

在肝癌的研究中，通過表面標志物CD133分離肝癌細胞系Huh7中的腫瘤干細胞，應用雙向電泳及質譜技術鑒定出6種差異表達蛋白，其中Transgelin基因的表達在腫瘤干細胞中增高25倍，且與腫瘤細胞的侵襲轉移能力增高明顯相關［16］。

在結腸癌的研究中，有研究通過無血清培養的方式分離出人結腸癌SW1116細胞中的腫瘤干細胞。分選出的腫瘤干細胞對紫杉醇、依托泊苷、順鉑等化療藥物的耐藥性明顯增高，且端粒酶活性明顯增高，蛋白質組學技術鑒定出10種差異表達蛋白，功能涉及細胞周期調控、凋亡調控、增殖等［24］。值得引起關注的是，Fang等［17］首次將蛋白組學技術應用到實體瘤腫瘤干細胞的研究中，通過CD133從13例結腸癌手術切除標本中分離腫瘤干細胞，并以液相色譜串聯質譜技術鑒定出CD44、CD166、CD29、CEACAM5、cadherin 17、CD133 及 biglycan 共七種結腸癌腫瘤干細胞特有的表面標志物。有研究者應用無血清培養基培養以形成干細胞球的方式在結腸癌肝轉移的腫瘤組織中分選腫瘤干細胞，并通過1D和納升級液相色譜串聯質譜(Nano LC-MS/MS)技術鑒定出32個差異表達基因，其中凋亡抑制基因BIRC6在腫瘤干細胞中表達顯著增高，“敲低”BIRC6的表達后，腫瘤干細胞對奧沙利鉑和順鉑的敏感性明顯增高。

3．胚胎癌干細胞:Dormeyer等［19］采用電場軌道阱回旋共振組合質譜(LTQ-Orbitrap-MS)等技術發現胚胎干細胞HUES-7與胚胎癌細胞NT2/D1存在著不同的特異性胞漿蛋白，功能涉及信號傳導、細胞連接、細胞轉運功能等。Chaerkady等［20］發現胚胎干細胞(H1;WA01)及胚胎癌細胞NTERA-2 cl．D1表達差異在 2倍以上的蛋白有 200多種，包括 HSPB1，MAPK1，TPS3I11，NFKBIA，S100 calcium-binding protein-A4等基因，這些基因上調與惡性表型有關。Hayman等［23］采用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，從維甲酸誘導分化前后的胚胎癌干細胞中篩選出4個特異的胚胎癌干細胞分化標志物。

4．乳腺癌:Steiniger等［18］采用H33342染色的方法從乳腺癌細胞MCF-7中分選出側群細胞，蛋白組學技術發現41種差異蛋白在腫瘤干細胞中表達增高1．5倍，而有17種差異表達蛋白在腫瘤干細胞中表達下降1．5倍。

5．前列腺癌:Dai等［25］應用等電聚焦毛細管電泳(cIEF)及納升級液相色譜-質譜聯用(nanoRPLC-MS/MS)分析技術，發現人前列腺癌裸鼠移植瘤的腫瘤干細胞中有169個差異表達基因，并通過生物信息學分析發現這些基因涉及凋亡、細胞增殖、炎癥反應、轉移等功能。Lee等［27］通過雙向電泳及質譜分析的技術，發現人前列腺癌細胞DU145中腫瘤干細胞的Cofilin及Annexin A5的表達增高。

6．膠質瘤:Nilsson等［21］應用應用JAK2/STAT3磷酸化抑制劑WP1193處理惡性膠質瘤腫瘤干細胞GSC11，比較處理前后的差異表達蛋白，發現STAT3/IL-6/HIF1信號通路在腫瘤干細胞致瘤性及自我更新能力中有重要作用。

五、展望

雖然腫瘤干細胞蛋白質組學研究已有了一些應用，并取得了一些成果，但是該領域的研究才剛剛起步，還有很多的障礙需要克服。其中最重要的障礙就是腫瘤干細胞在腫瘤組織或細胞中的比例非常少，如何進一步提高富集的效率，提高蛋白質組學技術的靈敏性可能是研究的關鍵。其他的障礙也包括如何通過將包括樣品收集和處理、數據處理等操作程序進行標準化以獲得一致的研究結論等。蛋白質組學研究不僅有助于我們對腫瘤干細胞病理生理學特性的理解，也將為研發新的抗腫瘤藥物、克服腫瘤的耐藥、復發、轉移提供有價值的線索。

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