晚期非小細胞肺癌患者體液標本表皮生長因子受體突變基因檢測的進展

王 灃 操樂杰

盡管肺癌的診斷、分期、治療日趨規范化，但由于缺乏有效的早期篩查制度和方法，加之傳統化療的療效出現平臺期，導致肺癌患者總體預后依然很差，5年生存率僅為16%［1］。隨著分子腫瘤學的發展，發現表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達產物，其突變參與了腫瘤的生長、侵襲等過程。針對這一靶點的藥物酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、埃克替尼等)開創了肺癌分子靶向治療的先河。臨床實踐證明非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者間存在分子靶向藥物療效上的差異，這種差異主要體現在肺癌患者體細胞EGFR是否存在分子突變。而發生分子突變的患者療效極佳，可見突變檢測對選擇合適人群進行靶向治療具有重大意義。過去對EGFR突變檢測多是基于組織標本，但晚期肺癌患者組織標本往往很難獲得，因此找到一種理想的標本，建立合適的檢測方法進行EGFR突變檢測是當前研究的熱點。現就NSCLC患者極易反復獲取的體液標本中的EGFR基因突變檢測及意義加以綜述。

一、EGFR的常用檢測方法

直接測序法被公認為是EGFR基因檢測的“金標準”，該法能確切判斷突變堿基及突變位置，而且可以發現新的突變基因。但被測標本DNA純度要求不能低于30%突變才能檢出，因而，往往需要選用微切割腫瘤組織標本［2］。為了滿足臨床的廣泛需求，國內外學者應用不同EGFR檢測方法對晚期NSCLC患者的體液標本進行過嘗試，目前報道較多的三種是蝎形探針擴增阻滯突變法(SARMS法)、突變體富集法PCR、變性高效液相色譜技術(DHPLC法)。

1．SARMS法:該方法引入了應用于等位基因鑒定的Scorpions蝎形結構特異性探針。該探針包含一個與3'，端共價相連的PCR引物，僅僅能識別突變序列，而不識別正常序列，附加錯配突變設計在3'，端引物序列中，從而實現特異性的擴增。Scorpions探針與ARMS技術聯合應用比常見的熒光探針PCR技術更為先進，其可檢測單個突變，提高了方法的特異性及檢測結果的可靠性。國內廈門艾德公司在基于實時PCR平臺的基礎上結合了特異引物和雙環探針兩種技術，建立了ADx特異擴增技術。該試劑盒與國際公認EGFR檢測試劑盒在檢測靈敏度及檢測結果的一致性上已經被國內多家醫院所驗證，有望使SARMS法對EGFR突變的檢測實驗過程更加快捷，費用更經濟。但SARMS法也有局限，它是針對已知突變基因進行相應探針的設計，因此無法檢測未知突變基因。

2．突變體富集PCR法:該方法基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化野生型的EGFR基因片斷，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增，從而實現產物的富集，再使用PCR放大和凝膠電泳技術，根據產物的大小進行突變的判斷。該方法同樣是基于PCR技術，因此實驗過程中避免污染尤其重要，目前該方法主要用于19、21外顯子的基因突變檢測，不能檢測約占全部突變10%左右的其他EGFR基因的突變。

3．DHPLC法:變性高效液相色譜技術是近年來國內外興起的一種用于分析核苷酸片段的技術平臺。該系統可在非變性、部分變性、完全變性三種條件下運行，其中部分變性條件適用于EGFR基因突變的檢測，能分離、識別野生型及突變型DNA雙鏈。DHPLC法在EGFR突變基因檢測峰型中易于判讀，且有利于發現未知突變基因，具有快速、高通量、操作簡單、費用低廉等優點，該方法不足的是只能檢測有無突變，而不能區分突變類型。

二、不同標本中EGFR突變基因檢測在臨床的應用

1．外周血標本中EGFR突變基因的檢測

早在1977年，Leon等［3］已發現腫瘤患者血清、血漿中循環DNA含量明顯高于健康人群。其來源可能與原發腫瘤的釋放、外周循環中腫瘤微轉移灶的釋放、腫瘤細胞凋亡或壞死釋放有關［4］。采用PCR探針技術和熒光技術，對肺癌患者外周血標本進行EGFR突變基因檢測，在試驗設計中應盡可能的將血和腫瘤組織進行匹配或者對同一類型標本采用不同方法檢測，并通過觀察分子靶向治療效果以驗證循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)及外周血游離DNA(cell free DNA，cfDNA)中EGFR突變基因檢測結果的可靠性。

(1)外周血游離DNA(cfDNA):指外周血細胞外DNA，存在于血清、血漿中的游離DNA都可用來檢測EGFR突變基因。二者的優劣性采用血漿似乎要比血清更好，這可能與血清中的混合成分有關，有研究稱隨著炎性細胞數量的增加，血清循環DNA比例增加，而血漿并非如此［5］。血標本具有獲取方便的優點，但容易被污染。相關研究表明cfDNA被污染量與標本采集后血清、血漿分離時間成正相關［6］。此外cfDNA穩定性較差，血清、血漿cfDNA標本在處理前應保存于－20℃或是更低的環境，且濃度波動范圍很大(10～1200 ng/ml)，片段短(－180 bp)，由腫瘤細胞凋亡、壞死產生的cfDNA在總cfDNA中的比例不等(3% ～93%)，不同腫瘤類型cfDNA的比例亦不一致，并且與腫瘤的分期、分級、大小及位置有關。鑒于以上特點，cfDNA用于基因檢測對方法的選擇要求很高，直接測序法存在著很大的局限性。Kimura等［7］研究發現cfDNA在血標本中敏感度僅為66%，特異度為71%，這可能會導致部分EGFR突變陽性的患者因為檢測方法選擇不當而失去谷氨酸轉移酶抑制劑治療的機會。較敏感檢測方法SARMS法在cfDNA的應用報道較多，2007年Kimura報道采用SARMS法檢測cfDNA樣本中EGFR的敏感性為85%，特異性94%，腫瘤組織和血標本突變檢測結果一致率高達92．9%［8］。在用血清標本中檢測EGFR陽性的患者給予吉非替尼治療獲得的中位 PFS明顯長于 EGFR陰性的患者(174 d vs 58 d，P=0．044)。在此之后Maheswaran報道12例肺癌患者游離血漿標本中有4例EGFR陽性［9］。Liu等［10］對18例血漿標本中用SARMS法突變檢出率為80%。以上研究所示的突變檢出率波動幅度很大，其原因可能與入組的條件等有關，其中腫瘤的分期也影響著EGFR突變檢測結果。Bai等［11］對230例ⅢB期-Ⅳ期NSCLC腫瘤組織和cfDNA標本使用DHPLC法進行了19、21號外顯子EGFR突變分析，結果顯示cfDNA和相匹配的腫瘤組織突變一致性達79．7%。此外Yung等［12］對微數字PCR方法進行過嘗試，該法能檢測單個突變DNA分子，并可精確地區別突變和野生型序列，對血漿標本中EGFR突變檢測的敏感性和特異性能達到92%和100%，較SARMS法更適合EGFR突變檢測。

目前突變體富集PCR法應用較廣泛。惠福海等［13］應用突變體富集PCR法檢測EGFR基因21號染色體突變情況，在23例腫瘤組織中有8例突變陽性，其中采用cfDNA檢測中7例得到一致結果(87．5%)。突變體富集PCR法實現了產物的富集，He等［14］在此基礎上聯合采用直接測序法，在血漿cfDNA中發現19、21外顯子EGFR突變檢出率達49．3%，與配對的腫瘤組織檢測結果一致性為94．4%。cfDNA中EGFR突變陽性較野生型患者在應用吉非替尼二線治療后PFS有很大差異(7．609個月vs 2．877個月，P=0．002)。Jiang等［15］證實對cfDNA采用突變體富集PCR檢測EGFR突變結果和組織標本中檢測結果的一致性可達93．1%，且cfDNA中突變體富集法的敏感性和特異性分別為77．8% 和100%，相反非富集PCR技術的敏感性和特異性則要遜色很多。

(2)外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC):外周血成份復雜，為了降低檢測結果的假陽性，產品的純化十分必要。通常每毫升血中CTC數量僅為1～10個，這較混合存在的白細胞及紅細胞數量少很多，導致檢測難度較大。相對較成熟的CTC濃縮檢測技術是近年來發展起來的一種較好的方法。

CTC檢測在乳腺癌、結腸癌等癌癥患者中涉及頗廣。Maheswaran等［9］基于微流體技術設計了一個分離、純化芯片，針對上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗體，分離出NSCLC患者CTC，并對分離后的CTC采用SARMS法進行EGFR基因突變檢測，發現其靈敏度達92%。CTC標本在EGFR突變檢出靈敏度方面較cfDNA標本高，但其腫瘤細胞的純化技術復雜，目前難以推廣，其優越性有待進一步證實。

采用NSCLC患者外周血標本進行EGFR基因突變檢測具有可行性，cfDNA標本較CTC標本在目前的應用更為廣泛。血標本EGFR基因突變檢測結果對指導臨床治療很有價值。鑒于標本自身的特點，對檢測方法而言敏感性較高的SARMS法及突變體富集PCR法更受青睞，尤其是采用試劑盒的SARMS法在操作上更有明顯優越性。

2．胸腔積液標本中EGFR突變基因的檢測

惡性胸腔積液在各類型肺癌中很常見，尤其在肺腺癌中更為多見，其形成往往與腫瘤的直接侵犯或是胸膜轉移有關，合并積液的患者往往提示腫瘤晚期不能接受外科手術［16］。研究發現胸腔積液脫落細胞是檢測致癌基因點突變很有價值的標本，很多學者對此類標本用作EGFR基因突變檢測進行了探討。

(1)胸腔積液DNA片段游離細胞(cell-free pleural fluid):惡性胸腔積液中往往存在著片段DNA，但其濃度很低，Kimura等［17］收集了43例ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者的胸腔積液游離細胞標本，應用直接測序法對EGFR18-21號外顯子進行了突變分析，突變檢出率為25．6%，其中女性、非吸煙人群檢出率較高。該組中的27例患者給予吉非替尼靶向治療后病灶達到PR、SD的各有7例，檢測結果均為突變陽性。而突變陰性的患者均為疾病持續進展者。Wu等［18］采用直接測序法在該類標本中的突變檢出率達高68．4%，這一差異可能是所檢測的范圍和入組的條件不同所致。

何臣等［19］對30例NSCLC患者胸腔積液游離DNA進行了EGFR19及21外顯子突變分析，并比較了酶切富集PCR法及非酶切富集PCR法對胸腔積液EGFR基因突變檢出率的差異。結果證實酶切富集PCR法的檢測靈敏性顯著高于非酶切富集PCR法(50．0%vs 23．3%)，這一結果與Zhang等［20］報道的檢出率相當(50．0%vs 31．0%)。酶切富集PCR法對胸腔積液DNA游離細胞標本EGFR突變基因檢測是一種較直接測序法更為靈敏、簡便可行、能解決問題且費用低廉的方法，具有臨床應用價值。

(2)胸腔積液細胞(pleural effusion cells):由于肺癌胸腔積液標本包含有突變成分、正常細胞、炎癥細胞及間皮細胞等混合成分，導致DNA純度不夠，入組的患者檢出突變率多較低。Kimura等［21］收集了24例NSCLC患者的胸腔積液，采用胸腔積液細胞，同時應用直接測序法和敏感性較高的SARMS法對EGFR18-21號外顯子突變基因進行檢測。共檢測出8例突變陽性患者，其中有3例在兩種方法中出現一致的結果，而另外5例僅在敏感性高的SARMS法檢測中出現陽性突變。值得關注的是在入組的患者中有7例得到吉非替尼治療，其中4例達到PR，直接測序法檢測到陽性的患者只有2例達到PR。在此研究中直接測序法突變檢出率僅為12．5%，而SARMS法突變檢出率為33．3%。這預示惡性胸腔液是一種可選的被檢測標本類型，SARMS法靈敏度明顯高于直接測序法。值得注意的是Zhang等［20］對胸腔積液無細胞懸液和脫落細胞沉渣兩種標本EGFR基因突變檢測結果進行了比較，發現二者在敏感性高的突變體富集PCR方法中檢測結果具有一致性。

在異質性高的胸腔積液標本中，敏感性較高的SARMS法和突變體富集PCR法檢測擁有較大的優勢。胸腔積液標本的留取、儲藏較為簡便，和石蠟組織標本比較更為新鮮，而且該類標本EGFR陽性檢測結果有指導臨床靶向治療的價值。

3．其他:支氣管鏡檢查、痰液檢查是臨床診斷肺癌的重要手段，但面臨的困難依然是不能獲得足夠的組織以滿足病理評估后的基因分析。Hiroyuki等［22］收集了61例肺癌患者的支氣管內膜上皮細胞襯液標本，應用PNA-LNA鉗夾法進行了EGFR突變檢測，結果發現檢測敏感率達58．3%。該方法簡單、安全，且未直接接觸瘤體，在進行活檢、灌洗、刷片前只需用一微量樣本采集探針進行上皮細胞襯液采集即可，避免了血液雜合成分的影響。表明氣管鏡采集微量標本是另外一種檢測腫瘤基因改變的補充方法。痰液標本含有呼吸道上皮脫落細胞，是容易獲得的生物學標本。痰細胞學已用于肺癌的診斷分析，但腫瘤相關細胞DNA或游離DNA量相對于炎性細胞DNA的量較少，因而目前尚未見到以該類標本進行EGFR基因突變檢測的相關文獻。

對NSCLC患者接受TKI治療前進行EGFR基因突變基因的篩選，無論采用哪種標本類型，應保證足夠多的腫瘤細胞，盡量剔除非腫瘤細胞。突變檢測的方法及細胞純化的技術尚有待進一步改進，體液標本與組織標本檢測結果的一致性及體液標本突變陽性患者靶向獲益的情況報道不一，尚需更多的研究進一步證實。對于不能獲得組織標本的NSCLC患者應用外周血、胸腔積液等體液標本進行EGFR突變基因檢測將為患者TKI治療提供有價值的依據。

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