Rho/Rho激酶在肺癌中的作用及其潛在治療靶點

吳冠楠 宋 勇

Rho蛋白在細胞內起到分子開關的作用，Rho/ROCK信號通路在細胞的粘附、變形、遷移、增殖、凋亡等多種行為方面起到重要調控作用。Rho蛋白的異常表達或激活被發現與肺癌細胞生物學特征和患者預后等有顯著相關性，并可能成為潛在治療靶點。現就Rho/ROCK信號通路在肺癌中的作用及其潛在治療作用做一綜述。

一、Rho相關信號通路

1．Rho蛋白與Rho激酶和mDia1:Rho蛋白或Rho GTP酶(Rho GTPase)是Ras超家族的組成之一，為小分子量(相對分子量20×103～30×103)GTP結合蛋白，目前已從哺乳動物中分離出20種Rho蛋白家族成員，分別為 Rho(RhoA、RhoB 和 RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3和 RhoG)、Cdc42(Cdc42Hs、G25K 和 TC10)、Rnd(RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6 和 Rnd2/Rho7)、RhoD(RhoD 和 Rif)、RhoH/TTF、Wrch(Wrch-1和 Wrch-2)和 RhoBTB(RhoBTB1 和 RhoBTB2)亞型，其中以 Rho、Rac、Cdc42研究較為集中［1］。Rho蛋白在細胞內以兩種狀態存在，即與GTP結合狀態(活化型)和與GDP結合狀態(失活型)。與GTP結合的Rho蛋白主要定位于細胞膜，具有磷酸酶活性，并可以和效應分子相互作用，從而啟動下游信號通路;與GDP結合的Rho蛋白主要定位于細胞質，為失活狀態。調節Rho蛋白失活與活化狀態轉換的分子主要有以下兩類:鳥苷酸轉換因子(guanosine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)。GEFs經一系列信號轉導被激活后，催化Rho．GDP轉化為Rho．GTP，從而使Rho蛋白被激活;GAPs則參與激活Rho．GTP本身的GTP酶活性，導致Rho．GTP水解為 Rho．GDP，從而使 Rho蛋白失活［2］。GEFs和GAPs具有相對特異性，如NET1的底物僅為RhoA，而GEF-H1的底物則包括RhoA、RhoB和RhoC，FilGAP的底物僅為Rac1，而p190-RhoGAP的底物則包括RhoA、RhoB和RhoC［3］。此外鳥苷酸游離抑制因子(guanosine nucleotide dissociation inhibitor，GDIs)也參與細胞內Rho蛋白活性的調節，GDIs可以和細胞內處于失活狀態的Rho蛋白結合，增加Rho蛋白的穩定性［4］。

Rho激酶(Rho associated kinases，ROCKs)是Rho蛋白的主要效應分子，可被磷酸化而激活，它為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，相對分子量約為160×103，ROCK分子結構主要分為三部分:N端的激酶結構域、中間的螺旋結構域和C端的PH結構域，其中Rho蛋白通過作用于C端的雙螺旋部分而使ROCK激活，ROCK有兩種異構體:ROCK1(ROCKβ)和ROCK2(ROCKα)，二者均分布廣泛，但ROCK1在非神經組織中含量相對更高，而ROCK2在肌肉和大腦中含量相對更高［5］。

mDia1(mammalian diaphanous1)是黑腹果蠅翅膀中diaphanous蛋白的同源物，屬于成蛋白(formin)相關蛋白家族，它是Rho蛋白除ROCK外的另一效應分子［6］。

2．Rho相關信號通路的生物學功能:Rho蛋白通過活化與失活狀態之間的轉換調節下游信號通路的開啟與關閉，從而起到分子開關的作用。Rho/ROCK信號通路、Rho/mDia1信號通路和其他Rho相關信號通路在細胞骨架的調節中發揮重要作用，可以通過促進肌球蛋白輕鏈磷酸化、肌動蛋白聚集、調節微管等促進細胞收縮、聚集［5-6］。Machacek等［7］發現細胞移行過程中，在突觸形成前，RhoA、Cdc42和Rac1在突觸形成部位均被激活，其中以RhoA最先活化，而后于稍遠離突出前端的2 μm部位，Cdc42和Rac1也被激活。三者活化程度與突觸生長速度呈正比，RhoA的活化啟動了突觸的形成，而Cdc42和Rac1的活化則進一步促進突觸的擴展。用血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)處理的內皮細胞中，RhoA、Cdc42和Rac1迅速被激活，暗示Rho蛋白可能是血管內皮生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)直接的下游分子之一。RhoA的活化可以抑制內皮細胞的屏障功能，RhoA、Cdc42和Rac1的活化可以促進血管基底膜的降解、內皮細胞增殖、移行以及毛細血管的形成，Rho蛋白在新生血管形成中發揮重要的作用［8］。多種信號周期調節蛋白均是Rho/ROCK信號通路下游分子，如細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白D3、細胞周期蛋白A、P21和P27等。RhoA、Cdc42和Rac1可調節其表達或活性，從而促進細胞的G1/S期轉換，促進細胞增殖［8-9］。上皮細胞極性是其重要的特性之一，細胞極性丟失與細胞遷移、浸潤和上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等密切相關。Chartier等［10］研究發現，Rac1和PI3K的激活可以使上皮細胞丟失極性，抑制二者中的任意一個均可使該效應顯著降低。

二、Rho與肺癌

目前，在多種腫瘤中均已發現Ras基因的突變。Rho雖然作為Ras超家族的一員，但其突變在腫瘤中并不多見，而Rho的異常表達和活化卻常見于多種腫瘤［11］。在肺癌組織或細胞系中，Rho的表達異常和激活已被多個研究所證實。Touge等［12］研究發現，RhoA在大細胞肺癌細胞系中呈高表達，而在肺腺癌細胞系中表達相對較低，但RhoA在各種肺癌細胞系中均被顯著激活，尤其以小細胞肺癌細胞系最為顯著。癌性錨蛋白重復序列(gann ankyrin repeats)蛋白是新近發現的腫瘤蛋白，Man等［13］研究發現，在Ras突變的肺癌中，gankyrin表達量顯著增高，增高的gankyrin促進RhoA與GDIs結合，從而使得游離狀態RhoA減少，抑制RhoA/ROCK/PTEN信號通路，從而導致Akt的持續活化，后者則是Ras突變誘導細胞轉化及腫瘤形成的關鍵。上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)可以抑制非小細胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)細胞的增殖和浸潤，Asnaghi等［14］研究發現，E-cadherin抑制NSCLC細胞增殖作用主要是通過下調RhoA或Cdc42的表達。敲除RhoA或Cdc42基因后，NSCLC細胞增殖和浸潤能力均顯著下降。肺癌患者的預后與其分期密切相關，Chen等［15］發現，肺癌患者的癌組織中Cdc42呈過表達，而且Cdc42過表達與患者的高TNM分期和高淋巴結轉移存在顯著相關性，抑制Cdc42的表達可以抑制肺癌細胞系801D的遷移、浸潤等。K-Ras基因是重要的原癌基因，K-Ras基因突變在肺癌的發生中起到重要作用。Kissil等［16］研究發現Rac1在K-Ras突變誘導的肺癌中發揮關鍵作用，Rac1敲除可導致K-Ras突變上皮細胞的增值能力大幅度下降。轉移是肺癌的一大特征，Ikoma等［17］研究發現肺癌組織中RhoC表達增加，過表達的RhoC并不影響肺癌細胞的生長和增值，但可顯著增加肺癌細胞的遷移和浸潤能力，并促進其基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成和分泌，并增加MMP-2的活性。由此可見，部分起到“促癌”作用的Rho蛋白不僅在肺癌的發生中起到重要作用，更可能與肺癌細胞增值、遷移、浸潤、腫瘤血管形成、癌栓形成、EMT等相關，從而與肺癌的轉移密切相關。

與RhoA、Cdc42和Rac1等在肺癌中的“促癌”不同，RhoB具有潛在的“抑癌”作用。Mazieres等［18］研究發現，隨著肺癌浸潤性增高，RhoB在癌組織中的表達量大幅度下降，同時RhoB表達丟失與肺癌的高分期、高浸潤性、低分化、高增值指數等存在顯著相關性，而經處理的RhoB過表達的A549細胞的增殖、生長等均顯著下降。隨后的研究發現，肺癌中RhoB的低表達或不表達主要是由組蛋白低乙酰化所引起，在應用組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑處理后的肺癌細胞系中可見顯著的RhoB復表達［19］。而RhoB低表達可促進支氣管上皮細胞的遷移和浸潤，其主要是通過激活AKT1并依賴于Rac1的激活，從而導致PI3K/AKT信號通路被激活［20］。Howe等［21］研究發現，RhoB在內皮細胞的遷移、出芽和毛細血管形成中發揮重要作用，其部分機制為抑制RhoA/ROCK信號通路。由此可見，RhoB表達丟失可能是肺癌細胞獲得浸潤性的特征之一，其作用機制可能和PI3K/AKT信號通路被激活有關，而且Rho蛋白的調控網絡可能也發揮重要作用。

三、Rho相關藥物在肺癌治療中的潛在作用

法舒地爾(fasudil)為Rho激酶的抑制劑，具有廣泛的藥理作用。A549細胞是人肺腺癌上皮細胞系，Zhu等［22］研究發現，法舒地爾可以抑制A549細胞MMP-2和MMP-9的活性，并且下調RhoA和VEGF的表達，抑制A549細胞的增殖、移行和浸潤等生物學行為。NCI-H446細胞為人小細胞肺癌細胞系，Yang等［23］研究發現，法舒地爾可以抑制NCI-H446細胞的MMP-2和MMP-9的活性，并促進caspase3的活化和過氧化物酶增殖體活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的降解，促進細胞凋亡。法舒地爾還可以抑制NCI-H446細胞的生長、增值、黏附、移行、浸潤等生物學行為。VEGF誘導的內皮細胞移行是腫瘤血管形成和腫瘤血管轉移的重要部分。Yin等［24］研究發現，法舒地爾可以抑制人臍帶血管內皮細胞張力絲形成、黏著斑聚集及其酪氨酸激酶活性，從而抑制VEGF誘導內皮細胞的移行、抗凋亡和內皮細胞管道化作用，抑制腫瘤血管的形成。而且法舒地爾可以抑制VEGF誘導的肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而影響腫瘤新生血管的功能。法舒地爾在體外實驗中對肺癌細胞和對新生血管的抑制作用已被證實，但其確切的分子機制尚未明確，而且目前尚缺乏令人信服的法舒地爾對肺癌治療作用的相關體內試驗。但法舒地爾治療其他惡性腫瘤的動物試驗結果顯示，法舒地爾可以抑制惡性腫瘤在動物模型體內的轉移。Ying等［25］研究發現，在小鼠肝癌腹膜播散模型中，法舒地爾可顯著減少腹膜癌結節數量和腹水的形成，在人纖維肉瘤肺轉移小鼠模型中，法舒地爾可顯著減少肺部轉移灶的數量。在原位乳腺癌細胞接種小鼠模型中，法舒地爾也可以顯著減少癌結節數量。但該研究同樣顯示出法舒地爾的抑制作用與結節大小成反比的趨勢，提示法舒地爾主要作用于腫瘤轉移的早期，其預防轉移的意義可能更大。

羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-CoA reductase inhibitor)，即他汀類(statins)藥物，具有廣泛的藥理作用。他汀類藥物主要可通過抑制類異戊二烯的合成而影響Rho的膜定位，抑制Rho蛋白的活化，從而阻斷相關信號通路活化下游效應分子［26］。Zhao等［27］研究發現。洛伐他汀(lovastatin)可抑制RhoA等Rho蛋白的活化，從而抑制EGFR二聚體的形成和AKT的活化，洛伐他汀和吉非替尼(gefitinib)在多種腫瘤細胞系中均表現出協同的細胞毒性作用，但對于三期NSCLC患者的臨床資料研究顯示，洛伐他汀并未增加厄洛替尼臨床療效，但洛伐他汀聯合厄洛替尼有改善預后的趨勢，二者生存曲線分離相對較明顯［27］。

四、小結

肺癌轉移是其導致患者死亡的主要原因之一，Rho在細胞中的作用極其廣泛，且存在復雜的調控網絡，參與調解細胞的多種生物學功能，在肺癌的發生、發展中也發揮重要的作用，尤其在肺癌的轉移中發揮重要作用，但其具體機制尚有待進一步研究。目前法舒地爾、他汀類藥物是潛在的可用于肺癌輔助治療的藥物，法舒地爾對肺癌的治療作用主要集中于體外實驗，而對其主要作用機制、體內試驗、臨床研究等尚有待進一步研究。他汀類藥物的體外實驗同樣顯示其對細胞毒性的協同作用，但目前相關的回顧性臨床研究結果并不支持其作為三期NSCLC患者的輔助治療，相關研究中合用洛伐他汀的病例總數也過少，而且并非臨床隨機對照(randomized controlled trial，RCT)研究，目前尚需進一步的、更大樣本量、患者臨床特征相對局限的RCT研究。

RhoA可以促進EGFR形成二聚體，RhoB可以抑制AKT活化。RhoA、Rac1也可以促進AKT活化。Rho與EGFR和AKT的相互作用也可能會成為肺癌治療，尤其是對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor)耐藥患者治療的新的突破點。

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